Chromatinimmunoprecipitation(ChIP)를 통한 hypoxia-inducible factor(HIF)-1α에 의해 발현의 조절을 받는 유전자의 database화 및 기능연구

초록

목적 : 뇌졸중, 심근경색, 암 등 여러 질병과 관계있는 저산소증(hypoxia)에서 발현의 조절을 받는 유전자들, 특히 HIF-1a전사조절인자에 의해 조절되는 새로운 유전자를 발굴하여 심근경색시 세포사멸에 관여하는 기작을 밝힘으로서 이의 손상을 줄이는 예방법 개발의 이론적 기초를 제공하고자 한다. 방법 : Cardiac myoblast cell line인 H9c2에서 Hypoxia를 유도할 수 있는 여러 조건들, 즉 CoCl_(2) 처리, 2% O_(2) chamber에서의 배양, HIF-1a의 transfection시 HIF-1a가 induction 되는지를 western blotting으로 확인을 하고, 이의 처리에 의한 HIF-1a target 유전자들의 induction을 RT-PCR로 확인하였다. 이를 바탕으로 DNA chip을 이용하여 HIF-1a를 유도한 세포와 정상상태의 세포에서 발현의 증감을 보이는 유전자들을 발굴하였다. 그 중에서 HIF-1a에 의해서 2배의 감소를 보이는 세포사멸과 관련이 있는 c-FLIP에 초점을 두고 저산소증 시 세포사멸에 대한 민감성이 높아지는 기전에 대하여 연구하였다. 결과 : 저산소증 시 유도되는 HIF-1a의 transfectiont이 c-FLIP의 alternative splicing variant인 c-FLIP(L) 및 c-FLIP(S) 모두 단백질의 양이 감소되는 동시에 Fas에 의한 세포사멸 민감도도 증가하는 것으로 나타났다. Fas에 의한 세포사멸의 민감성 증가가 c-FLIP의 감소에 기인한 것인지를 알아보기 위하여 각각의 c-FLIP을 과 발현 시켰을 때 세포사멸 민감도가 억제됨을 확인할 수 있었다. HIF-1a에 의한 c-FLIP의 감소가 Fas에 의한 세포사멸 민감도를 증가시키기 위해서는 DISC에서의 caspase-8의 활성화가 이루어져야 하는데 이를 알아보기 위하여 HIF-1a의 과 발현 시 활성화됨을 확인하였고 또한 caspase-8 선택적 억제제를 처리했을 때 세포사멸이 억제됨을 확인함으로써 c-FLIP의 감소가 일어난다 하더라도 caspase-8의 활성화가 주요하게 작용함을 확인할 수 있었다. 결론 : 심장세포들은 정상의 상태에서는 Fas에 의한 세포사멸에 대하여 저항성을 보이는 반면에 저산소증 상태에서는 민감성이 높아지는 기전중의 하나로서 저산소증 시 유도되는 HIF-1a는 c-FLIP의 수준을 감소시키는 동시에 caspase-8을 활성화시켜 Fas에 의한 세포사멸 민감성을 증가시키는 것으로 사료된다.

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