11번 염색체중 200kb non-coding region의 지놈구조 분석

초록

목적 : 본 연구는 genome imprinting과 연관성이 있는 인간염색체 11번의 단완에 존재하는 H19 와 IGF2의 두 유전자간 거리 약 200 kb의 염기배열을 결정하고, 이들 유전자 사이의 정확한 exon, intron 그리고 단순반복배열 및 CpG island 등을 분석하여 당뇨질환 환자의 조기진단 및 예방체계를 구축하는데 한국인 표준 의 genome 구조를 제시하는 것을 목표로 한다. 방법 : 정상인의 혈액에서 lymphocyte를 분리한 후, agarose plug에 10㎍/plug이 되도록 만든 후, 각 plug에서 digestion된 high molecular weight(HMW) DNA가 고르게 분해될 수 있는 제한효소의 양을 결정하여 plug에서 100-200 kb 전후의 HMW DNA를 회수한다. 회수된 DNA를 BAC vector에 ligation하여 BAC library를 제작한다. BAC library를 screening하기 위하여 high density replica membrane을 제작하고, IGF2 혹은 H19 유전자 단편을 probe로 이들 두 유전자를 포함하는 BAC clone을 확보한다. 확보된 BAC clone을 2-3 kb의 DNA로 단편화한 shotgun library를 제작하여 염기배열을 결정하고, bioinformatics를 이용하여 두 유전자간의 genome 구조를 밝힌다. 결과 : 1) 건강한 한국인의 혈액에서 genomic DNA를 추출한 후, agarose plug에 embedding하여 고분자 DNA의 분해를 방지하고, 제한효소 HindⅢ로 처리한다. Pulsed field gel electrophoresis를 이용하여 고분자 genomic DNA를 분리한 후, 100-150 kb의 genomic DNA 단편만을 분리 · 정제하였다. 2) Lymphocyte cell에서 분리한 cDNA와 genomic DNA에서 H19와 IGF2 유전자에 대한 PCR 단편을 얻었고, 이들 단편의 염기서열은 기존의 서양인과 98 %의 상동성을 보였다. 3) 인간게놈프로젝트에 의해 발표된 11p15.5에 위치하고 있는 IGF2와 H19간 거리를 분석한 결과 약 145 kb로 예측되었다. 결론 : 11번 염색체의 총 길이는 대략적으로 142 Mb로 보고되고 있으며, 본 연구 과제인 IGF2와 H19간 거리는 약 145 kb 떨어져 있음이 최근 자료를 분석하여 알게 되었다. 이것은 최초에 예상했었던 두 유전자간 의 거리 약 200 kb 보다는 짧은 것으로, 이는 IGF 유전자와 해당유전자의 상보적인 염기배열이 인접해 있어 초기에 이들 유전자간 거리를 예측하는데 어려움이 있었던 것으로 판단된다. 본 연구에서는 이 영역에 대한 genomic DNA의 구조를 밝히기 위해 BAC libraiy를 제작하였고, 이중에서 두 유전자를 포함하는 clone을 찾아내어 두 유전자간의 genome 구조를 정확히 밝힘으로써, genome imprinting과 당뇨병 질환과의 상관관계를 밝히는데 중요한 정보를 제공할 것이다.

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