병원성 가시아메바 superoxide dismutase의 분자생물학 및 면역학적 병원성 기전 연구

초록

목적 : 가시아메바 Fe-SOD의 분자생물학적 및 면역학적 병원성 기작 연구를 통해 가시아메바 감염시 나타나는 숙주-병원체 상호작용을 규명하고자, 병원성 가시아메바 Fe-SOD 유전자의 클로닝 및 발현, 생화학적 특성을 분석하였다. 방법 : 배양한 병원성 가시아메바 Acanthamoeba castellanii로부터 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 수행, cDNA를 합성 후, degenerate PCR 과 RACE를 실시하여 전체 유전자 서 열 확보, 유전자서열의 비교 및 genome DNA를 이용한 southern blot 등을 통하여 DNA 구조를 분석하였다. AcFe-SOD 유전자를 pQE-30 발현벡터에 클로닝한 후, E. coli를 이용하여 발현시켰다. Ni-NTA affinity column을 이용하여 재조합단백을 정제한 후, 효소활성도 및 생화학적 특성(pH, 온도 안 정성)을 분석하였다. 결과 : Denature PCR 및 5'⟶3' RACE를 통하여 총 791 bp로 이루어진 full-gene sequence가 얻어졌다. 가시아메바 Fe-SOD 유전자는 5개의 exon과 4개의 intron으로 구성되어있었으며, Southern blot의 결과, single copy임이 확인되었다. SDS-PAGE의 결과로 발현 단백질이 약 25 kDa임이 관찰되었고, SOD 특이염색을 실시하여, Fe-SOD 재조합 단백질이 SOD 활성을 나타냄이 입증되었다. 정제한 자연 단백과, 재조합 단백의 생화학적 특성을 비교한 결과, 모두 넓은 범위의 pH에서 강한 활성을 보였고, 열안정성에 있어서도 37도 에서는 모두 안정했으나, 70도에서는 모두 상대적으로 불안함을 보여, 재조합 단백질과 native 단백질의 성상이 매우 유사함이 확인되었다. 결론 : 가시아메바의 Fe-SOD 유전자를 클로닝 하여, E. coli를 이용하여 발현시켰으며, 이 재조합 Fe-SOD 단백질은 가시아메바 native 단백질과 생물, 생화학적 성상이 유사하여 기능 분석에 유용하게 이용될 것으로 기대되었다.

키워드