HBV cccDNA 안정성 조절을 통한 만성 B형 간염 완치제 개발 연구

초록

ㅁ 연구 목표 ㅇ HBV cccDNA 안정성 조절 유효물질의 B형간염 치료 약물로써의 가능성 확인 - (1차년도) HBV cccDNA 안정성 조절 유효물질 선별 - (2차년도) 분자/세포 수준(in vitro)의 항바이러스 유효물질 효능 검증 - (3차년도) HBV 감염 마우스 생체 내에서의 유효물질 효능 검증 ㅁ 연구내용 및 결과 ㅇ 기 확보된 인공 cccDNA 실험모델 최적화 - Tet -on/off 시스템이 포함된 CRE 발현벡터 제작 및 확인 : Tet -on 또는 off 시스템 모두 벡터내 mini -CMV에 의해 발현제어에 문제가 있음에 확인됨 - ERT2creERT2 시스템이 포함된 CRE 발현벡터 제작 및 발현제어 확인 ㅇ HBV cccDNA 안정성 유효물질 선별 - 구축된 LoxP -HBV 시스템을 통한 약물 라이브러리에서의 HBV cccDNA 안정성 관련 유효물질 스크리닝 방법 확립 * 세포에 대한 direct -lysis 및 qPCR 확인 시스템 개발 - 항바이러스 및 FDA 승인 화합물 총 379종에 대한 스크리닝 및 10종의 후보 유효물질 확보 * Valaciclovir HCl, Adenosine, Danoprevir, L -cycloserine, Phenytoin sodium, Idoxuridine, Amatadine, Germacrone, D -cycloserine, Patchouli alcohol ㅇ 세포 수준에서의 유효물질 최적 치료조건 확립 - 10종에 대한 MTT assay 및 HBV 발현 세포주(HepAD38)에서의 HBeAg/HBsAg 및 cccDNA 감소 효능평가 수행 → D -cycloserine 선정 ㅇ in vitro/in vivo 에서의 유효물질 처리효과 검증 - HBV 감염세포에서의 D -cycloserine 효과 확인 ㅇ HBV 감염 소동물 모델에서의 유효물질 효능 평가 - HBV 감염 마우스 모델에서의 D -cycloserine 효과 확인 ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ D -cycloserine에 의한 cccDNA 감소 메커니즘 규명을 통한 항 -HBV 신규 약물 발굴(FDA 승인 화합물에 대한 약물 재창출) ㅇ HBV cccDNA 타겟 스크리닝이 가능한 인공 cccDNA 생성 시스템에 대한 지적재산권 확보(CRE 발현제어 가능한 loxP -HBV 세포주)

Hepatitis B virus (HBV), a small hepatotropic DNA virus, contains 3.2 kbp partially double-stranded DNA, called relaxed circular DNA (rcDNA), which is converted to covalently closed circular DNA (cccDNA) in the nucleus. cccDNA is challenging to study because of low copy numbers even in primary human hepatocytes, despite the availability of efficient nucleotide analog drugs; this is an important barrier in developing a cure for HBV infections. In this study, we established a direct cell lysis and PCR-based screening system with an artificial recombinant HBV cccDNA (rcccDNA), with the rcccDNA form derived from a linearized loxP-HBV genome through CRE expression, with the aim of identifying drugs that could reduce the rcccDNA amount. In total, 379 anti-virus and FDA-approved drugs were tested using this screening system. Ten drugs, including danoprevir, cycloserine, phenytoin sodium, amantadine, and germacrone, demonstrated a 32–35% decrease in the cccDNA amount, as assessed using qRT-PCR. After further analysis in a HepAD38 cell line, D-cycloserine, a potential candidate chemical for reducing the HBV cccDNA amount, also demonstrated a decrease in HBeAg, HBsAg, and cccDNA amounts.