Vibrio vulnificus의 Pulsed Field Gel Electrophoresis 표준화와 분자역학적 특성연 구

초록

목적 : PulseNet Korea 및 PulseNet 아시아태평양 네트워크에서를 대상으로 한 효율적인 분자생물학적 유형분류법을 선별하고 이 중 PFGE에 대한 표준 시험법을 작성, 확인하고자 하였다. 방법 : V. vulnificus의 확인은 API 20E kit를 이용한 생화학 동정과 vvhA 유전자를 확인하여 수행하였다. Riboprinting은 Bruce의 방법에 따라, 대상 균주의 전체 DNA를 제한 효소로 절단 후, 대장균의 rrnb rRNA가 포함된 probe로 hybridize한 후, automatic RiboPrinter를 이용하여 수행하였다. PFGE는 Gautom의 방법을 변형하여 수행되었다. 용균된 plug는 NotⅠ과 SfiⅠ으로 각각 절단한 후, 전기영동 하였고, 전기영동 결과는 BioNumerics software를 사용하여 분석하였다. 결과 : 3차년도에서는 PFGE 조건을 NotⅠ의 경우에는 3.5〜20초 pulsetime, 22시간 전기 영동으로, SfiⅠ의 경우에는 block 1은 2~10초 pulsetime, 13시간 전기영동으로, block 2는 20~25초 pulsetime, 6시간 전기영동으로 교체하여, 이 조건이 V. vulnificus에 적합한지를 확인하였다. 2000년〜2007년 환자분리주 101주와 2005년~2007년 환경분리주 92주에 대해 확인한 결과, NotⅠ의 경우에는 band 구분능력에서 전년도 정립 기준보다 개선되었으나, 유형이 너무 세분화되어 각 유형들 및 실험주들 사이에 상동성이 확인되지를 않았다. 반면 SfiⅠ의 경우에는 전년도 정립 기준에 비해 band 구분능력의 개선뿐 아니라, 일부 임상 및 환경 분리주에서 유사도가 높게 나타나 V. vulnificus에 적합한 방법으로 판단되었다. SfiⅠ을 이용한 PFGE 유형은 66%의 유사도를 기준으로 SA에서 SE까지 5개의 cluster로 구분되며, 임상균주는 SC cluster에, 환경분리주는 SB 및 SD cluster로 집중되는 결과를 보였다. 주 cluster는 SB와 SC로 각각 실험주의 22.9%와 35.5%가 이에 속하였다. SB 및 SC cluster는 각각 2, 3개의 subgroup으로 세분가능하였는데, 각 subgroup내에서 일부 임상분리주와 환경분리주 들간의 유사도가 89~100에 해당되는 소규모 집단이 존재함을 확인하였다. Ribotyping의 경우, 117주를 실험하여, 모두 106개의 ribotype으로 분류가능 하였다. 결론 : Ribotyping과 NotⅠ절단 PFGE는 분류능력이 너무 강하여 V. vulnificus의 유연관계 분석을 위한 실험법으로는 부적합한 것으로 판단된다. SfiⅠ절단 PFGE 역시, 분류능력이 강하였으나 일부 subgroup에서 유전적 연관도가 높게 나타나는 결과들이 상당수 있으므로 V. vulnificus를 위한 분자역학적 도구로 가장 유용하게 사용할 수 있다고 판단된다.

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