다제내성균 치료용 박테리오파지의 유전체 기반 특성분석 및 자원화

초록

ㅁ연구목표 ㅇ 다제내성 그람음성균 치료용 박테리오파지 개발을 위한 연구모델 확립 및 기반 기술 구축 ㅁ 연구내용 및 결과 본 연구는 다제내성균 감염 치료용 박테리오파지 개발을 위한 기반을 구축하는 것을 목표로 수행되었다. 이를 위해 박테리오파지 연구용 모델을 확립하고, 연구개발 전략을 수립하며, 치료제 개발을 위한 자원 확보 및 특성 분석을 진행하였다. 박테리오파지 연구를 위한 실험 프로토콜을 문헌조사, 외부 세미나 참석, 실험실 견학 등을 통해 정립하였으며, 15가지 실험 프로토콜을 확립하였고, 다제내성균 치료용 박테리오파지 연구개발 전략 수립을 위해 국내 박테리오파지 전문가로 구성된 자문위원회를 구성하여 자문결과에 따라 연구를 수행하였으며, 해외 파지 치료센터를 방문하여 임상적용 사례 및 라이브러리 관리 방법을 파악하였다. 국가 연구자원으로 활용할 수 있는 다양한 살균능을 가진 박테리오파지를 수집하기 위하여, 다제내성 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. bauamnnii를 숙주로 특이적으로 감염시키는 박테리오파지를 병원하수에서 분리하였다. 먼저, ESBL 생성 E. coli 및 K. pneumoniae를 숙주로 하는 박테리오파지를 확보하고 숙주특이성을 분석하였으나, carbapenemase 생성 균주에 대한 용균활성이 낮음을 확인됨에 따라 카바페넴 내성균을 숙주로 하는 추가적인 박테리오파지 수집이 이루어졌으며, 임상분리주를 활용한 연구를 통해 다양한 다제내성균 치료에 효과적인 후보군을 선별하였다. 추가적으로 확보한 박테리오파지의 숙주특이성을 분석한 결과, 특정 균주에 대한 높은 용균활성을 보이는 후보군을 선별하였으며, 특히 P. aeruginosa 특이적 박테리오파지는 넓은 숙주범위를 나타내었다. 반면, A. baumannii 특이적 박테리오파지는 숙주범위가 좁아 다양한 자원을 추가로 수집하여 스크리닝할 필요성을 확인 하였다. 연구 결과를 바탕으로 향후 다제내성균 박테리오파지 자원을 확보하기 위한 환경적 요인과 최적의 숙주세균 선발 전략을 제시하였다. 또한, 박테리오파지의 전장유전체 분석기술을 확립하여 안전성을 확인하고, propagation 단계에서 발생할 수 있는 돌연변이를 분석하였다. 숙주세균 결정인자 분석을 시도하였으나, 현재 사용 가능한 bioinformatics tool로는 제한적 분석이 가능하여 향후 데이터베이스 확장이 필요함을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구를 통해 다제내성 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii에 효과적인 박테리오파지 120주를 확보하였으며, 이들의 표현형적 및 유전형적 특성을 분석하여 치료용 박테리오파지 개발을 위한 기반을 마련하였다. 향후 국가 연구자원으로 활용 가능한 치료용 박테리오파지 라이브러리 구축 및 관리 방안 마련을 위하여 활용될 것이다. ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ 확보한 박테리오파지 연구 인프라와 자원, 연구 네트워크 등을 토대로 치료용 박테리오파지 라이브러리를 구축·운영하여, 향후 국내 파지 치료 도입에 필요한 파지자원을 제공할 수 있을 것으로 기대함

This study aimed to establish a foundation for the development of bacteriophages for the treatment of multidrug-resistant (MDR) bacterial infections. To achieve this, a research model for bacteriophages was established, research and development strategies were formulated, and bacteriophage resources for therapeutic development were collected and characterized. Experimental protocols for bacteriophage research were established through paper review, attendance at external seminars, and laboratory visits. A total of 15 experimental protocols were developed. Additionally, an advisory committee composed of bacteriophage experts was formed to devise a research strategy for the development of bacteriophages targeting MDR bacteria. Based on the committee’s recommendations, research was conducted, and visits to overseas phage therapy centers provided insights into clinical applications and library management methods. To collect bacteriophages with diverse bactericidal activity for national research resources, bacteriophages that specifically infect MDR E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, and A. baumannii were isolated from hospital wastewater. Initially, bacteriophages targeting ESBL-producing E. coli and K. pneumoniae were isolated, and their host specificity was analyzed. However, due to their low lytic activity against carbapenemase-producing strains, additional bacteriophages targeting carbapenem-resistant bacteria were collected. Through studies using clinical isolates, potential candidates effective against various MDR bacteria were selected. Further host specificity analysis of the newly acquired bacteriophages identified candidates with high lytic activity against specific strains. In particular, P. aeruginosa-specific bacteriophages exhibited a broad host range, whereas A. baumannii-specific bacteriophages had a narrower host range, highlighting the need for additional resource collection and screening. Based on these findings, environmental factors and optimal host bacterial selection strategies for securing MDR bacteriophage resources were proposed. Furthermore, whole-genome sequencing techniques for bacteriophages were established to verify safety and analyze mutations that may occur during propagation. While attempts were made to analyze host bacterial determinants, currently available bioinformatics tools allowed only limited analysis, indicating the necessity of database expansion in the future. In conclusion, this study secured 120 bacteriophage strains effective against MDR E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, and A. baumannii. The phenotypic and genotypic characteristics of these bacteriophages were analyzed, laying the groundwork for the development of therapeutic bacteriophages. These findings will be utilized for establishing and managing a therapeutic bacteriophage library for national research resources.