CNTF의 promoter 분석을 통한 발현 조절 연구

초록

목적 : CNTF는 IL-6 family cytokine에 포함되며 여러 신경세포의 생존과 분화에 작용하는 신경성 장인자로 알려져 왔다. 그러나 아직 CNTF 발현이 어떻게 조절되는지 알려져 있지 않고, 이에 대한 세포·분자생물학적 연구는 미진하다. 따라서 본 연구에서는 쥐의 CNTF 유전자 5' upstream region을 cloning하여 발현에 중요한 promoter region을 결정하고, 신경아교세포와 근육아세포에서의 발현조절 기전을 밝히고자 하였다. 방법 : 본 연구에서는 먼저 CNTF의 promoter region을 luciferase reporter유전자를 가지는 벡터에 클로닝한 다음 여러 serial deletion mutants 와 주요전사인자 결합부위를 site-directed mutagenesis로 돌연변이 시킨 mutants를 제조하여 신경아교세포와 근육아세포에서의 발현을 조사하였다. 결과 : 첫째, CNTF promoter의 활성에 필요한 최소 promoter region은 전사 시작 부위에 인접하여 존재하는 AP-1과 Sp 결합부위를 포함하는 부위 -109 upstream region으로 추정되었고 core promoter region에 존재하는 AP-1 과 Sp 결합부위가 CNTF 발현에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 둘째, CNTF promoter의 전사활성은 promoter의 -51~-37 region이 deletion 되었을 때 활성이 크게 증가하는 것으로 미루어 이 부위에 repressor가 붙어 CNTF 발현을 down-regulation 하는 것을 추정할 수 있었다. 그리고 전사인자 예측 프로그램을 이용하여 이 부위에 Glil이 결합할 것으로 추정되었으며, 이 부위 deletion mutant의 활성이 신경아교세포에서 보다 근육아세포에서 높은 활성을 나타내고, Glil mRAN가 근육아세포 보다 신경아교세포에서 높이 발현되며, Glil 발현벡터를 co-transfection하였을 때 전사활성이 감소되는 것으로 미루어 Glil이 CNTF의 발현에 중요한 repressor로 작용하는 것을 추정할 수 있었다. 셋째, CNTF promoter의 전사활성이 여러 inflammatory cytokine을 처리하였을 때 약 50% 정도 감소되었는데, 이는 cytokine에 의 해 활성화되어 nuclear localized CtBP1이 Sp1에 결합하여 Sp1의 전사활성을 억제하여 나타나는 것으로 확인되었다. 결론 : CNTF의 전사활성은 -109 upstream region core 프로모터에 존재하는 AP-1과 Sp 전사인자에 의해 조절 받는 TATA-less 프로모터이며, Glil이 주요 repressor로 작용한다. 그리고 inflammatory cytokines에 의한 CNTF 전사활성의 억제는 Spl에 CtBPl의 결합을 통하여 일어나는 것으로 확인되었다.

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