Candida glabrata 임상분리주에서 azole계 내성 관련 단백체 연구

초록

목적 : 국내 임상에서 분리되는 C. glabrata 균주를 대상으로 항진균제 감수성 검사를 실시하고 azole계 항진균제중 하나인 fluconazole에 대한 감수성, 내성 균주를 대상으로 세포내, 세포막 단백질을 분리하고 발현된 단백질을 상호 비교 분석하고 동정함으로써 fluconazole 내성에 관여하는 단백질을 동정 확인하고자 하였다. 방법 : 임상에서 분리된 G. glabrata 46 균주를 수집하여 실험에 사용하였다. 항진균제 감수성 검사(CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute)는 미량액체 희석법을 사용하여 4가지 항진균제(fluconazole, voriconazole, amphotericin B, 5-flucytosine)을 대상으로 감수성 시험을 실시하였다. 여러 항진균제 중 azole계 항진균제인 fluconazole 감수성인 균주와 내성인 균주를 선택하였다. 균주간의 변이차를 줄이기 위해 감수성 균주 2균주와 내성인 균주 2균주를 선별하여 단백체 분석 실험에 사용하였으며 선별한 균주를 대상으로 성분별 단백질(세포내, 세포막)을 분리하여 단백체 성분 분석을 실시하였으며 각각 감수성별 reference map을 작성하였다. 분석된 reference map을 기본으로 fluconazole 감수성 균주의 reference map과 fluconazole 내성균주의 reference map을 상호 비교하여 단백질 발현이 증감한 양상을 분석하였다. 결과 : 수집된 전체 C. glabrata 46 균주 중 fluconazole 내성 균주는 4균주 SDD(susceptible dose dependent) 균주는 9균주 감수성 균주는 33 균주로 확인되었다. C. glabrata 균주 중 fluconazole 감수성 균주로 D-31(MIC 0.125㎍/㎖), D-33(MIC 0.125㎍/㎖) C. glabrata 균주를 fluconazole 내성 균주로 D-116(MIC 64㎍/㎖) D-149(MIC 64㎍/㎖) C. glabrata 균주를 단백체 실험의 대상 균주로 선별하였다. 대상 균주의 세포내 단백질과 세포막 단백질을 대상으로 2D 전기영동 결과 다양한 양상의 단백질체을 나타내었으나 대부분의 단백질은 산성 pH 쪽에 60kDa 단백질 이상의 위치에서 확인되었다. 세포막 단백질체의 경우 세포내 단백질체보다 훨씬 적은 단백질 위치가 확인되었으며 산성 pH 근처에 다수의 단백질이 세포내 단백질체의 경우 확인된 반면 세포막 단백질체는 중성 pH에 전체 단백질이 분포하는 것으로 확인되었다. 세포내 단백질과 세포막 단백질에 대해 fluconazole 감수성 두 균주의 reference map과 내성 두 균주의 reference map을 각각 작성하고 상대적으로 1.5배 이상 발현량이 감소하거나 증가한 단백체를 확인한 결과 세포내의 경우 21개의 단백질을, 세포막은 26개의 단백질을 확인하였다. 발현이 증가되거나 감소한 단백질을 대상으로 LC-MASS로 동정을 실시한 결과, 3-oxoacid CoA transferasel, putative oxidoreductase, IPP1p, glucose-a-phosphate uridvlyltransferase, mitochondrial aconitate hydratase 등이 확인되었다. 결론 : azole계 항진균제중 하나인 fluconazole에 대해 감수성, 내성 균주를 대상으로 세포내 단백질과 세포막 단백질의 발현 양상을 비교한 결과 1.5배 이상의 발현차를 나타낸 단백질은 세포내의 경우 21개의 단백질이, 세포막은 26개의 단백질이 확인되었으며 일부 단백질이 동정되었다.

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