HBV cccDNA 조절 RNA 결합 단백질을 이용한 만성 B형 간염 신치료제 개발연구

초록

ㅁ 연구 목표 ㅇ RNA 결합단백질의 B형 간염 치료 약물로써의 가능성 확인 ㅁ 연구내용 및 결과 ㅇ 본 연구에서는 HBV 생활사에 필요한 단백질이나 핵산 생성에 영향을 미치는 RNA 결합단백질 (RNA binding protein)을 유효 후보물질로 선별하고, 이들이 궁극적으로 cccDNA의 활성화나 안정성에 영향을 주는 항-HBV 효과를 줄 수 있는지를 확인하여 HBV를 타겟하는 신치료 물질로서의 가능성을 확인하고자 함. ㅇ HBV 감염 일차인간간세포의 전사체 분석 결과로부터 HBV 감염에 의해 유의미한 발현 변화를 보인 RNA 대사 관련 10종 (EWSR1, ABCF1, HMGA1, KANSL2, NOP56, RPL28, PABPC4, RBM10, RBM14, SAMD4B) 이상의 RNA결합단백질을 선별하고, 기존 선행결과와의 종합 분석으로 EWSR1을 유효물질로 최종 선정함. ㅇ EWSR1 단백질의 항-HBV 효과를 평가하기 위해서 세포주-벡터 기반과 세포주 -virion 기반 HBV 발현 모델에서 EWSR1 단백질의 과발현 또는 발현 감소를 유 도하였으며, 이 때 HBV parameter (HBeAg/HBsAg, HBV DNA/RNA, HBV core 단백질) 변화가 확인되어 HBV 증식 및 전사에 영향을 주는 것을 확인함. 즉, EWSR1 과발현에 의하여 HBsAg/HBeAg 분비, HBV rcDNA 및 RNA 생성 감소를 보였기에 EWSR1의 항-HBV 효과를 확인함. ㅇ EWSR1 단백질은 기존에 HBV enhancer I, II에 결합하여 HBV 활성을 증가시킨 다고 알려진 HNF4와 HNF1 등과 enhancer와의 결합은 저해시키면서 HBV enhancer I, II에 직접 결합 가능성이 있음을 ChIP assay를 통해 확인되었기에, HBV 전사 제어 기전에 관여함이 확인됨. ㅇ 아데노부속바이러스 기반 HBV 감염 마우스 모델에서 pAAV-HBV1.3 (20 ug)으로 감염 후 pEWSR1 (5 ug)을 2일 간격, 2번 주입하였을 때, 감염 7일차의 마우스 혈청에서 EWSR1 발현에 의해 HBeAg 항원이 유의미하게 감소되었으며, 마우스 간조직에서 HBV DNA가 감소됨을 확인함. 또한, 마우스 간조직의 면역화학염색을 통해 EWSR1 과발현에 의해 HBV core 단백질의 발현이 감소됨을 확인함. 이와 같이 HBV 감염 마우스 모델에서 EWSR1 단백질의 항-HBV 효과를 확인함. ㅇ 유효물질인 EWSR1을 대상으로 mRNA 기술 활용 항바이러스제 가능성을 타진하고자 EWSR1 mRNA를 설계/합성하여 세포주-virion 기반 HBV 발현 모델에서 발현 유도하였을 때, HBV parameter (HBeAg/HBsAg, HBV DNA/RNA)들의 감소가 확인되어, 항-HBV 효과 유도를 확인함. ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ EWSR1 단백질의 만성 B형 간염바이러스 표적 유효물질에 대한 지적 재산권 및 국가핵심 원천기술 확보 ㅇ 다양한 질병과 세포 기능 조절인자인 RNA결합단백질인 EWSR1이 HBV 전사를 제어하여 항-HBV 효과를 주는 새로운 타겟으로 간세포에서 과발현에 의한 항 -HBV 효과를 유도하는 새로운 HBV 치료 전략의 가능성 제시 ㅇ EWSR1 mRNA 기술을 이용한 치료제 가능성 확인으로 다양한 바이러스 감염에 대한 제어기술 개발 연구에도 활용 기대

Hepatitis B virus (HBV) remains a global health challenge as a major cause of hepatocellular carcinoma (HCC), despite the availability of preventive vaccines. Current antiviral therapies, primarily nucleos(t)ide analogues, effectively suppress viral replication but fall short of achieving a complete cure due to the persistence of covalently closed circular DNA (cccDNA) and potential drug resistance. Identifying novel therapeutic targets is therefore critical for curative strategies. HBV is an enveloped virus with a partially double-stranded relaxed circular DNA (rcDNA) genome that is converted into cccDNA upon infection. The cccDNA serves as a transcriptional template regulated by four promoters and two enhancers, modulating the production of viral RNAs and proteins. Host factors significantly influence these processes. In a previous study, we utilized RNA-sequencing to identify 149 genes with altered expression in HBV-infected primary human hepatocytes, highlighting RNA-binding proteins (RBPs) involved in mRNA metabolism and alternative splicing. Among these, the EWSR1 gene encoding the EWS protein emerged as a potential host restriction factor. EWS, a multifunctional RBP implicated in RNA splicing and transcriptional regulation, was previously linked to enhanced replication in other viruses such as HCV and SARS-CoV-2, but its role in HBV remained unexplored. Our findings suggest that EWSR1 represses HBV transcription by inhibiting Enh I/Xp and Enh II/Cp activity through the reduction the binding affinities of hepatocyte nuclear factors HNF4α and HNF1α to enhancers. Overexpression of EWSR1 delivered via plasmid vectors induced viral clearance in HBV mouse models. These results establish EWSR1 as a novel therapeutic target, providing a basis for developing curative strategies against HBV.