큐열 국내 분리주의 특성 연구 및 면역 후보물질 탐색

초록

ㅁ 연구목표 ㅇ 난배양성인 큐열 병원체 연구 실험실 구축을 통해 국내 분리 큐열균의 연구 활성화 ㅁ 연구내용 및 결과 ㅇ 큐열균 연구를 위한 임상 네트워크 구성 및 실험실 인프라 구축을 위해 전국 감염내과를 대상으로 네트워크를 구성하였으며, 제주도를 제외한 전국 11개 대학병원이 참여하여 큐열 의심환자 발생시 검체 수송 및 진단법, 병원체분리에 대한 표준지침을 마련하였다. ㅇ 임상네트워크 및 질병관리청에 보관된 큐열균의 배양을 위해 감염동물 모델을 이용한 병원체 분리를 시도하였으며, SCID 마우스의 사용이 병원체 분리에 많이 사용지만 주기적인 마우스 구입등의 문제로 인해 Blab/c 마우스에 면역 억제제 투여 후 감염하는 것이 균분리에 효율적이라는 것을 확인하였다. 또한 감염된 마우스의 혈액에서는 SCID마우스와는 다르게 항체가 생성되어 병원체 분리 후 혈액을 추가적으로 채취하여 혈청을 추가 실험에 사용할 수 있는 장점이 있었다. ㅇ 매개체분석과와 협업을 통해 설치류 유래 진드기로부터 큐열균을 분리하려고 시도하였으나, C. burnetii like bactera만이 detection되어 분리에는 실패하였다. 그러나 농가 지역(소, 염소)에서 채취한 진드기에서 병원체 분리는 과제 종료 후에도 지속적으로 진행하고자 한다. ㅇ 환자에게서 분리된 병원체는 세포내 증식이 제한적이여서 마우스-세포 감염cycles을 통해 adaptation을 하여야한다. 이에 본연구에서 면역억제제를 투여한 마우스 감염 후 spleen에서 Vero cell로 재감염을 통해 균을 재분리하는 과정을 거처 최종적으로 세포와 Cell-free media에서 증식을 원활하게 하였다. 이 과정을 총해 Cell-free media에서 10일 배양시 OD600=1.0의 농도로 배양이 가능하게 하였으며, 이를 이용하여 면역 후보물질 발굴에 사용하였다. ㅇ 위의 방법으로 배양된 균주에서 Total protein을 정제 후 2-DE을 수행하엿으며, 이후 Membrane으로 단백질을 transfer하여 Fibronectin과 Collagen IV로 Immunoblot 한 결과 최종적으로 C. burnetii 외막단백질 중 13개 단백질을 Fibronectin과 Collagen IV에 부착하는 단백질로 추정하였다. ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ 큐열 연구 인프라 구축을 통한 큐열 연구의 활성화 ㅇ 국내 큐열 분리주의 특성분석을 통한 진단제 및 백신 개발을 위한 기초 자료 제공 ㅇ 향후 세포내 기생 세균 연구 진단법 구축 및 다양한 실험에 대한 실험방법 제시

In order to establish a clinical network and laboratory infrastructure for Q fever research, a network was formed targeting infectious disease departments nationwide, and 11 university hospitals nationwide, excluding Jeju Island, participated to establish standard guidelines for specimen transport and diagnostic methods and pathogen isolation in the event of a suspected Q fever patient. In order to culture Q fever stored in the clinical network and the Korea Disease Control and Prevention Agency, we attempted to isolate the pathogen using an infected animal model. Although SCID mice are widely used for isolating pathogens, it was confirmed that infecting Blab/c mice after administering immunosuppressants is more efficient for isolating the pathogen due to problems such as periodic mouse purchase. In addition, unlike SCID mice, antibodies were produced in the blood of infected mice, which had the advantage of allowing additional blood collection after isolating the pathogen and using the serum for additional experiments. In collaboration with the vector analysis department, we attempted to isolate Q fever from rodent-borne ticks, but only C. burnetii-like bactera was detected, and isolation failed. However, we plan to continue to isolate pathogens from ticks collected from farm areas (cattle, goats) even after the end of the project. Pathogens isolated from patients have limited intracellular proliferation, so they must be adapted through mouse-cell infection cycles. In this study, we re-isolated the bacteria through reinfection with Vero cells from the spleen after infecting mice administered immunosuppressants, and finally facilitated proliferation in cells and cell-free media. Through this process, we were able to culture at a concentration of OD600=1.0 after culturing for 10 days in cell-free media, and this was used to discover immune candidate substances. After purifying total proteins from the strains cultured using the above method, 2-DE was performed, and the proteins were then transferred to membranes and immunoblotted with Fibronectin and Collagen IV. As a result, 13 proteins among the C. burnetii outer membrane proteins were ultimately estimated to be proteins that attach to Fibronectin and Collagen IV.