Nonspecific PCR로 증폭된 XcmI Cassettes를 이용한 T-vectors 제조방법

초록

유전자 증폭기술인 중합효소연쇄반응(PCR) 유전자산물은 3'-overhangs을 가지는 T-vector를 이용하여 직접 cloning하는 방법이 분자생물학 실험에서 널리 이용되고 있다. 본 연구에서는 두 XcmI 인지 사이트가 500bp 이상 떨어져 있어 T-vector로 전환 후 분리, 정제가 용이하고, 간단한 방법으로 조제된 pNB-T vector를 개발하였다. 두 XcmI 인지사이트를 가지는 XcmI cassette는 XcmI과 BamHI 그리고 NcoI 인지사이트를 가지는 primer를 이용하여 non-specific PCR로 증폭하였고, 이를 pBluescript SK(+)에 클로닝하여 pNB-T vector를 완성하였다. XcmI 외에 BamHI과 NcoI 인지사이트를 첨가한 것은 T-vector에 클로닝된 유전자를 하나의 제한효소(BamHI 혹은 NcoI)로 잘라낼 수 있어 subcloning을 용이하게 한다. pNB-T vector로부터 만든 T-vector의 cloning efficiency를 PCR로 증폭된 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자를 이용하여 시험한 결과 90% 였으며, 재조합된 plasmid를 BamHI과 NcoI으로 절단한 결과 정확한 크기의 DNA fragments가 잘려 나옴으로서 유용성을 확인 한 수 있었다. 이 논문에서 기술된 방법은 T-vector를 간단하게 조제하는 방법을 제시하고 있으며, XcmI cassette를 다른 여러 plasmid에 subcloning함으로서 다양한 T-vectors를 만들 수 있는 장점을 가진다.

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