심장질환 발생 원인 유전지표 발굴 및 표현형 특성 분석 예비연구

초록

ㅁ 연구목표 ㅇ 동물모델에서의 변이 유전자(MYH7) 연구 ㅇ 세포모델에서의 변이 유전자(MYH7) 연구 ㅁ 연구내용 및 결과 ㅇ 연구 대상 Human MYH7 유전자 확보 및 mutagenesis를 통한 변이 유전자 제작 - 대조군(2종): MYH7 WT, c.1988G>A;p.Arg663His - 실험군(3종): c.400T>C;p.Tyr134His, c.1464C>A;p.Phe488Leu, c.2419C>T;p.Arg807Cys * in vitro transcription을 통한 mRNA 합성 및 제브라피쉬에 mRNA 미세주입 시 단백질 번역 효율 및 안정성을 높일 수 있도록 MYH7 ORF 염기서열 외에 T7 RNA　polymerase promoter , human globin 유래 5’ and 3’-UTR, Kozak, Poly A, 3’ 제한효소 (Not I_5’overhang) 등 기타 염기서열을 포함 하여 유전자를 제작 ㅇ 제브라피쉬에서의 MYH7 유전자 변이 기능 연구 - MYH7 제브라피쉬 상동유전자 발현 패턴 분석 * myh6, myh7, myh7l 유전자 모두 골격근과 심장에서 발현하는 것을 확인하였으며, 수정 후 3일 이후로는 골격근에서의 발현이 줄어들고 심장에서 강하게 발현함을 확인 - mRNA 미세주입 후 단백질 발현 확인을 통한 미세주입 조건 확립 * 예비실험으로 Control(GFP) mRNA를 이용한 미세주입 조건 확립 - MYH7 변이 유전자 발현에 따른 심장 표현형 분석 * Antisense morpholino oligonucleotides(MO)를 이용한 endogenous MYH7 발현 저해시 심장 표현형 변화가 나타나는 것을 확인하였으나, MYH7 유전자변이 mRNA를 미세주입 하였을 때에는 단백질로의 translation 문제 등으로 인해 유의한 심장 표현형의 변화를 관찰하지는 못합 ㅇ 심근세포에서의 MYH7 유전자 변이 기능 연구 - 제브라피쉬에서 MYH7 변이 유전자 미세주입에 따른 단백질 translation 문제가 예상되어, 제작한 MYH7 WT 및 mutant sequence를 alphafold2를 활용하여 구조를 예측함 * 서열 분석 결과 생성되는 단백질의 구조적인 문제는 없는 것을 확인 - Rat cardiomyoblast (H9C2), newborn mouse ventricular myocyte (NMVM) 및 hESC-Cardiomyocyte 등을 대상으로 제작한 MYH7 plasmid construct transfection을 통해 세포 표현형 관찰 * 낮은 transfection 효율 등으로 인해 유의한 표현형의 변화를 관찰하지 못함 ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ 본 과제를 통해 제작한 MYH7 변이 유전자들을 활용하여 transgenic 또는 knock in 제브라피쉬를 제작하거나, 아데노바이러스를 이용한 세포내 일시적 과발현 시스템을 확립하여 MYH7 변이 유전자에 의한 심장 또는 심근세포 표현형 변화를 관찰할 수 있을 것으로 기대됨 * 본 예비 연구에 기반한 신규 과제 추진 등

The National Institutes of Health (NIH) has identified novel mutations in the MYH7 gene in patients with heart disease through the National Bio Big Data Development Project. In current project, preliminary studies were conducted to analyze the correlation between novel beta cardiac myosin heavy chain (MYH7) mutations and the development of heart disease using zebrafish and cardiomyocyte models. Initially, two control groups, which included MYH7 gene WT and mutation known to cause heart disease, along with three experimental groups (newly discovered mutants), were setup to generate gene models for the study. By using antisense morpholino oligonucleotides to inhibit the expression of the endogenous MYH7 gene, changes in cardiac phenotype were observed, confirming the expectation that MYH7 mutations would lead to changes in cardiac phenotype. The experimental setup for transient gene expression in zebrafish was established using GFP mRNA, and MYH7 mRNA for both the control and experimental groups was synthesized via in vitro transcription and introduced into zebrafish. However, contrary to expectations, gene expression was not observed. Assuming that there may be an issue with the constructed MYH7 gene, the MYH7 sequence was analyzed using AlphaFold2 to check for any potential structural problems. However, no indications of structural issues that could cause protein malfunction were found. Apart from the zebrafish phenotype observations, studies were also conducted on the expression of the MYH7 gene in cardiomyocytes. Due to low transfection efficiency, however, sufficient expression of the MYH7 mutant could not be induced and no significant changes in cell phenotype were observed. It is predicted that the reason for these results lies in the degradation of the large MYH7 protein-coding mRNA within the cells before it could be translated into protein. Additionally, the low transfection efficiency is also considered a contributing factor. In the future, experimental methods that improve transfection efficiency, such as using an adenovirus system, or employing transgenic or knock-in zebrafish models for permanent gene expression, could allow for the observation of phenotypic changes in the heart or cardiomyocytes caused by MYH7 gene mutations.