호흡기 바이러스 진단을 위한 single-tube multiplex-PCR법의 개발에 관한 연구

초록

목적 : 급성 호흡기 질환을 유발하는 인플루엔자바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, RS 바이러스, 아데노바이러스를 신속하게 형특이적으로 진단할 수 있는 multiplex-PCR 진단법을 개발하여 그 효능을 평가하였다. 방법 : 인플루엔자와 파라인플루엔자 바이러스는 HA, RSV는 N 유전자 그리고, 아데노바이러스는 Hexon과 Fiber에서 보존된 부위를 primer로 제작하여 바이러스 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였고, 아데노바이러스는 바이러스 DNA를 추출하여 PCR을 수행하였다. 결과 : 인플루엔자 바이러스 표준주를 이용하여 multiplex RT-PCR을 실시한 결과 인플루엔자 바이러스 A/H1N1, A/H3N2와 B형에 대해 각기 944 bp, 541 bp와 767 bp의 서로 다른 크기의 PCR 증폭산물을 얻어 염기서열을 분석한 결과 각 형의 해당 부위 염기서열과 일치하였다. 또한 국내에서 분리되어 아형이 확인된 바 있는 인플루엔자 바이러스 분리주 30주(A/H1N1형 8주, A/H3N2형 19주, B형 3주)에 대해 실험을 실시한 결과 역시 명확한 진단이 가능하였다. 파라인플루엔자 바이러스 1, 2 및 3형에 대해 각기 399 bp, 196 bp와 273 bp의 서로 다른 크기의 PCR 증폭산물을 얻었으며 NH 부위의 염기서열과 비교해 본 결과 각 형의 해당 부위 염기서열과 일치하여 정확 한 진단이 가능함을 확인하였다 아데노바이러스의 multiplex-PCR을 수행한 결과 각 형마다 다른 수의 서로 다른 크기의 PCR 산물이 관찰되었다. AV 1형의 경우에는 약 240 bp와 2,800 bp의 2개의 band, AV 2형의 경우에는 약 240 bp, 300 bp, 550 bp 및 2,800 bp의 4개의 band, AV 3형의 경우에는 약 250 bp와 1,000 bp의 2개의 band가 관찰되었고, AV 4형의 경우에는 500 bp의 하나의 band만이 관찰되었다. AV 5형의 경우에는 250 bp의 단일 band가 관찰되었으며 AV7형과 AV 7a형의 경우에는 250 bp와 500 bp의 두 개의 band가 관찰되었다. 따라서 한 번의 PCR반응으로 호흡기질환을 유발하는 6가지 형의 아데노바이러스를 형특이적으로 구분할 수 있었다. 또한 설사성질환을 야기하는 장관계(enteric) 아데노바이러스에 속하는 AV40형 및 AV41형의 경우에는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않아 호흡기질환을 야기하는 아데노바이러스형에 대해 매우 특이적임을 알 수 있었다. 개발된 multiplex-PCR의 진단법으로서의 유용성을 알아보기 위하여 1998년에서 2000년에 분리된 22개의 분리주를 이용하여 multiplex-PCR을 수행한 결과, 각 형에 대해 특이적인 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다. RS 바이러스 표준주를 이용하여 multiplex RT-PCR을 실시한 결과 RS 바이러스 A 및 B형에 특이한 334 bp와 183 bp의 서로 다른 크기의 PCR 증폭산물을 얻었고 NH 부위의 염기서열과 비교해 본 결과 각 형의 해당 부위 염기서열과 일치하였다. 결론 : 호흡기 감염 바이러스 진단을 위하여 개발된 multiplex PCR법은 호흡기 바이러스 질환의 진단에 소요되는 시간적, 경제적 손실을 최소화하여 신속한 유행예측에 따른 질환 확산 방지 및 환자의 치료 에 활용할 수 있을 것이다.

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