라이브러리를 이용한 니파바이러스 나노바디 개발

초록

연구 배경 및 목표 ㅇ 니파바이러스(NiV)는 동남아시아에서 매년 발병하며, 사망률이 40-70%에 달하는 고위험 병원체임.현재 인간에 사용 가능한 백신이나 치료제가 없으며, 향후 팬데믹을 유발한 가능성이 있어 WHO에서 연구 개발이 시급한 우선순위 병원체로 지정함. ㅇ 나노바디(VHH)는 낙타류 및 연골어류 항체에서 유래한 단일 도메인 항체로, 높은 안정성과 강한 결합 친화도 및 작은 크기(12~15kDa)로 인한 유연한 조직 침투 특성을 가짐. 또한, 구조적으로 유전자 수정 및 단백질 엔지니어링이 용이한 장점을 보유함. 최근 합성 나노바디 라이브러리를 활용한 고친화성 결합체 발굴 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 SARS-CoV-2에 대한 중화 나노바디가 다수 보고됨. ㅇ 본 연구에서는 니파바이러스를 표적으로 하는 합성 나노바디를 신속히 발굴하여 강력한 중화능을 갖는 나노바디를 확보하는 것을 목표로함. 연구 결과 및 결론 ㅇ 연구의 첫 단계로, 표적 NiV 분리주 유전자 서열을 선정한 후, 안정화된 수용성 삼량체(Trimer) 형태의 전융합(preF) 단백질을 발현하기 위한 클론을 제작함. 동시에, NiV-F 및 NiV-G 또는 VSV-G(Vesicular Stomatitis Virus-G) 입자 당단백질을 이용하여 감염성 니파슈도바이러스(NiVpp) 및 VSV 슈도바이러스(VSVpp)를 생산하였고, 이를 활용한 감염성 평가 시스템을 구축하였음. 중화 항체5B3를 대조군으로 사용하여 NiVpp 감염 억제를 확인함으로써 어세이를 검증함. 이를 바탕으로 preF 단백질이 5B3의 중화능을 경쟁적으로 저해하는 것을 입증함으로써 나노바디 스크리닝을 위한 기능적 항원임을 검증하였음. ㅇ 이후, preF를 표적 항원으로 사용하여, 합성 나노바디 라이브러리를 리보솜 디스플레이 방식으로 선별하였음. 총 7 회의 리보솜 디스플레이를 통해 preF 특이적 결합 나노바디 서열을 축적하고, 클러스터 분석을 수행하여 최종적으로 31개의 preF 결합 후보 나노바디를 확보하였음. 이 중 15개의 클론을 포유류 세포에서 발현 및 정제한 후, NiVpp 감염에 대한 중화 활성 및 preF 결합력을 평가함. 분석 결과, 나노바디 Top19는 400μg/mL 농도에서 NiVpp 감염을 50% 억제하는 것으로 관찰됨. 그러나, VSVpp 감염에 대해 유사한 중화능이 관찰되었고, 이는 잠재적인 광범위적 중화활성 가능성을 시사함. 따라서 추가 연구를 통해 원인을 규명할 필요가 있음. ㅇ 크기배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석에 따르면, 나노바디 Top19는 두 가지 올리고머 형태로존재하며, 두 가지 당화 가능성이 있는 형태로 확인됨. 또한, 화학적 교차결합 실험을 통해 나노바디 Top19 및 Top7이 preF와 복합체를 형성하는 것을 확인하였으나, Top2는 preF 복합체 형성이 관찰되지 않았음. ㅇ 본 연구를 통해 니파바이러스 항원을 성공적으로 분리 및 정제하였고, 최소 2개의 preF 결합 나노 바디를 확보하였으며, 13개의 중화 활성 평가가 진행된 나노바디 중 NiVpp에 대한 중화능이 확인 된 1개의 나노바디를 발굴하였음. 이러한 연구 결과는 합성 나노바디 플랫폼의 유효성을 검증하고, 이를 기반으로 향후 감염병 진단, 예방 및 치료제 개발을 위한 신속 대응 시스템으로 구축될 가능성을 제시한다는 점에서 중요한 의미를 가짐.

Research background & objective ㅇ The Nipah(NiV) causes annual outbreaks in Southeast Asia, resulting in a mortality rate of 40-70%. In the absence of licensed vaccines or specific therapeutics, NiV is listed as a priority pathogen of epidemic and pandemic potential by WHO(2023). ㅇ Nanobodies(VHH), are unique class of antigen-binding fragments derived from camelids and cartilage fish antibodies, known for their strong binding affinity, high stability, and tissue penetration due to their small size(12~15kDa). Their structure enables easier genetic modification and protein engineering, compared to conventional antibodies. Synthetic nanobody libraries are increasingly used to identify high-affinity binders, with numerous neutralizing nanobodies developed against SARS-CoV-2. ㅇ Here, this proposal aims to rapidly identify synthetic nanobodies targeting NiV, with the goal of selecting potent neutralizers. Results and Conclusion ㅇ First, the fusion F protein ectodomain encoded by a relevant NiV strain was used to design and produce a stabilized trimeric prefusion form of the protein (preF). In parallel, an infectious pseudotype NiV(NiVpp) was generated using either NiV-F + NiV-G surface antigens, or a Vesicular Stomatitis Virus G surface antigen (VSV-G) as VSVpp control. NiVpp was highly infectious, and the infectivity was specifically blocked by the 5B3 reference antibody. In contrast, purified preF was able to block the antibody-mediated neutralization, validating its use in nanobody screening. By using preF as a bait, a synthetic nanobody library was screened by ribosome-display. After 7 rounds of enrichment, a comparison of amplified nanobody sequence clusters led to the selection of 31 potential binders. Of these, 15 sequence-optimized nanobody clones were successfully expressed in the mammalian system and purified, and their NiVpp-neutralizing ability, along with preF bidning capacity, were assessed. ㅇ As a result, nanobody Top19 exhibited NiVpp-neutralizing activity at 400μg/mL of concentration. However, similar neutralizing activity was also observed against VSVpp, indicating that a potential broad-spectrum activity that requires further investigation. Additionally, the size-exclusion chromatography profiles and SDS-PAGE analysis revealed that nanobody Top19 existed in 2 oligomeric states as well as 2 possible sugar binding forms. By using chemical protein crosslinking, Top19 and Top7 nanobodies were found to be in complexes with preF, but not Top2. ㅇ Overall, the results illustrated that it is possible to produce a functional Nipah virus antigen and identify nanobodies able to bind (at least 2 clones) to preF, and to neutralize NiV pseudotyped virus (1 among 13 clones tested), in a relatively short period of time. Such a platform could be instrumental for epidemic and pandemic preparedness, not only for the development of therapeutics, but also of diagnostic tools.