심장질환자 특이 유전자 변이 제브라피쉬 표현형 구축

초록

본 연구는 제브라피쉬에서 사람의 심근병증 환자에서 발굴된 신규 변이 유전자 10종에 대한 발현패턴을 분석하고, 향후 이 유전자들의 loss-of-function 모델에서 나타나는 질환 표현형을 분석하기 위하여 신규 발굴 유전자 10종에 대한 유전자 발현패턴 분석 및 knock-out 제브라피쉬 founder 모델 구축을 목표로 진행되었음. 본 연구에서는 먼저 사람의 심근병증 환자 유전체 분석을 통하여 발굴된 신규 변이 유전자 10종에 대하여 제브라피쉬 ortholog 유전자들을 발굴하였으며, whole-mount in situ hybridization 기법을 통하여 수정 후, 2일째의 제브라피쉬 배아에서 이 유전자들의 발현패턴을 확인하였음. 또한 이 유전자들의 배아 및 성체에서의 발현을 좀 더 정확하게 규명하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였으며, 이를 통하여 1종의 유전자는 배아와 성체에서 모두에서 발현되었으며, 8종은 성체에서만 발현되었고, 1종은 배아 및 성체에서 발현되지 않음을 확인하였음. 또한 10종의 신규 변이 유전자들에 대한 gRNA/Cas9이 injection 된 제브라피쉬 배아에서 심장의 이상형성 유무를 분석함으로써 타겟 유전자들의 knock-out 표현형 분석을 완료하였으며, 이를 통하여 2종의 유전자 (tp63, col4a5) 에 대한 knock-out 배아에서는 심방의 크기가 증가하는 표현형을 확인하였으며, 1종의 유전자 (cacna1c) 에 대한 knock-out 배아에서는 심실의 크기가 증가하는 것으로 확인되었음. 다음으로 발굴된 10종의 신규 변이 유전자에 대한 knock-out 제브라피쉬 모델을 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 제조하기 위하여 10종의 유전자들에 대한 guide RNA (gRNA)를 제작하여 제브라피쉬 배아에 injection을 완료하였으며, 이들 중에서 성체로 먼저 자란 8종의 gRNA가 injection 된 배아에 대해서는 knock-out founder screening이 완료되었음. 나머지 2종의 유전자에 대한 gRNA가 injection 된 제브라피쉬들은 성체로 자라는 순서대로 knock-out founder screening이 진행될 예정으로 본 과제의 연구목표치 (총 7종)에 대해서는 추가 달성 완료하였음.

In this study, we aimed to analyze the expression patterns of 10 novel variant genes identified in human cardiomyopathy patients in zebrafish and to establish a knock-out zebrafish founder model to analyze the disease phenotype of these genes in a loss-of-function model. In this study, we first identified zebrafish orthologs for 10 novel variant genes identified through genomic analysis of human cardiomyopathy patients, and confirmed the expression patterns of these genes in zebrafish embryos on day 2 after fertilization by whole-mount in situ hybridization. RT-PCR analyses were also performed to more precisely define the expression of these genes in embryos and adults, which revealed that one gene was expressed in both embryos and adults, eight genes were expressed only in adults, and one gene was not expressed in both embryos and adults. We also completed the knock-out phenotyping of the target genes by analyzing the presence or absence of heart abnormalities in zebrafish embryos injected with gRNA/Cas9 for the 10 novel genes, and found that knock-out of two genes (tp63, col4a5) resulted in an increased size of the atrium, and knock-out of one gene (cacna1c) resulted in an increased size of the ventricle. Next, to create knock-out zebrafish models for the 10 newly identified genes using the CRISPR/Cas9 system, guide RNAs (gRNAs) for the 10 genes were produced and injected into zebrafish embryos, and knock-out founder screening was completed for the embryos injected with the gRNAs for 8 of the genes which were grown into adults first. Zebrafish injected with gRNAs for the remaining two genes will be screened for knock-out founders in the order in which tthey are raised to adulthood, thus fulfilling the research goal of this project (7 genes in total).