Chromatin immunoprecipitation을 통한 hypoxia-inducible factor (HIF-1 ) α에 의해 발현의 조절을 받는 유전 자의 database화 및 기능연구

초록

목적 : Chromatin immunoprecipitation(ChIP)를 활용하여, 뇌졸중, 심장질환, 폐고혈압, 암등 여러 질병과 관련돼 있는 저산소증(hypoxia)에서 유도되는 HIF-1α의 새로운 target 유전자를 발굴하여 그 기능을 밝히는데 있다. 방법 : 저산소증에서 유도되는 HIF-1α 전사조절인자는, 정상상태(normoxic condition)에서는 쉽게 분해되어 낮은 수준을 유지하지만 저산소증(hypoxia)에서는 stability의 증가로 핵 내에 높은 수준으로 존재하게 된다. 이때 HIF-lα는 저산소증에 적응하기에 필요한 유전자들의 발현을 위하여 이들 유전자들의 promotor에 결합된 상태로 존재하게 된다. 이 결합상태를 유지하기 위하여 formaldehyde를 첨가하여 고정시킨 후 초음파를 이용하여 500 bp 내외로 절편화시켰다. 이 절편화된 유전자조각들에서 HIF-lα에 결합돼있는 DNA 조각들만을 HIF-1α의 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 통하여 선별한 후 proteinase K를 처리하여 결합된 단백질들을 분해한 후 cloning vector에 cloning 했다. 이 DNA 절편의 존재여부는 sequencing vector의 polylinker에 있는 제한 효소로 잘라봄으로써 확인할 수 있었다. DNA 절편의 염기서열을 sequencing을 통하여 결정하고 Human genome project에 의해서 밝혀진 유전자들의 염기서열과 비교·분석하여 어떤 유전자의 promotor와 일치하는지를 확인하여 해당유전자를 동정하게 된다. 발굴된 유전자는 실제로 저산소증에서 induction 되는지를 northern blotting 또는 western blotting을 통하여 확인하였다. 결과 : C₀Cl₂처리 및 hypoxia chamber에서 DU145, HCT116, HUVEC, PC3 세포주들을 배양했을 때 HIF-lα가 induction됨을 확인할 수 있었고 또한 HIF-lα의 대표적인 target 유전자인 VEGF도 유도됨을 확인 할 수 있었다. DNA sequencing에 적합한 500-1 kb 정도의 fragment를 얻기 위한 sonication 조건으로 pulse 10초, Amp 20%, 25회가 적당함을 확인할 수 있었다. ChIP를 수행한 결과 총 100 개의 clone을 얻었으며 sequencing을 통한 이들의 동정에 있다. 결론 : Hypoxia 및 sonication의 조건들을 설정할 수 있었고 chromatin immunoprecipitation을 통하여 100 개의 clone을 확보할 수 있었다.

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