핵내 전사체의 발현 및 alternative splicing 분석을 통한 세포내 대사 조절기작에 관한 연구

초록

목적 : 질환 후보 유전자들의 alternative splicing 기전을 연구함으로써 전사체 다양성이 세포 내 대사조절기작 및 발병기전에 대한 연구와 이해 증진을 목적으로 한다. 방법 : 관련 Transcription Factor인 3개의 유전자와 Splicing Factor인 5개의 유전자들을 PCR을 통하여 동정하였고, 이들을 각각 인위적으로 과발현시킬 수 있는 Expression Vector에 cloning하여 각각의 construct를 만들었다. 이들 총 8개의 construct를 세포 내 과발현시켜 UCP3의 L-form과 S-form의 발현정도를 Transcription과 Translation 단계에서 확인하였다. 사용한 세포는 Human Skeletal Muscle Myoblast로서 Primary-like Cell을 사용하였다. 결과 : 3개의 TF(PPAR-alpha, PPAR-gamma 그리고 RXR-alpha)를 발현 벡터에 클로닝하여 HSMM에 transfection 시킨 후 UCP3의 Longform 발현양을 Real-Time PCR로 실험한 결과 PPAR-gamma가 UCP3의 발현에 다른 유전자들에 비해 비교적 높은 발현양을 관찰되었다. 5개의 SF(SRp40, SRp55c, 9G8, SC35 그리고 ASF/SF2)를 같은 방법으로 UCP3의 Longform 발현양 측정한 결과 ASF/SF2가 UCP3-longform 발현에 가장 큰 영향을 주는 것으로 관찰되었다. Real-Time PCR실험결과 정해진 PPAR-gamma와 ASF/SF2 유전자를 co-transfection 시킨 후 Immunoprecipitation 실험한 결과 직접적인 결합하는 것으로 밝혀졌다. 결론 : UCP3의 splicing을 조절할 것으로 예상되는 9개의 유전자를 각각 과발현시켜 isoform을 확인한 결과 PPAR-gamma와 ASF/SF2가 UCP3 유전자의 isoform을 조절함을 알 수 있었다.

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