Azole계 내성 Candida균의 내성기전 및 분자유전학적 특성 연구

초록

목적 : 임상에서 분리되는 칸디다 분리주의 균종 분포와 항진균제 내성 양상을 분석하고 azole계 항진균제 내성 균주를 대상으로 내성기전을 분석하고자 하였다. 방법 : 국내 1，2차 의료원과 종합병원에서 분리된 칸디다 균주를 대상으로 분리 검체별로 분리된 칸디다균의 균종 분포를 분석하였으며, 미량액체희석법(CLSI)을 사용하여 항진균제에 대한 칸디다균의 MIC를 측정하였다. Azole계 항진균제 fluconazole 내성을 나타낸 c. glabrata 내성관여 유전자를 분석하기 위하여 대상균주의 RNA를 분리하고 slot blot법을 사용하여 CgPDH1, CgCDRl1 유전자에 대한 유전자 발현을 검사하였다. 또한 ergosterol 합성 관여 유전자인 ERG11, ERG3 유전자의 돌연변이에 의한 내성 관여를 조사하기 위해 ERG 유전자를 PCR로 합성 증폭하여 염기서열 분석을 실시하였다. Genomic 수준에서의 내성과 연관된 유전자 발현은 대상균주의 RNA를 분리하고 genefish primer 120개를 이용한 RT-PCR를 실시하였으며 유전자간 발현도가 증가 혹은 감소한 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 분석하였다. 결과 : 전국의 칸디다균 총 612 균종의 분포도 조사 및 항진균제 MIC 분석 결과 C. albicans가 가장 높은 빈도로 검출되었지만 3차병원에서 NAC (non-albicans Candida)종의 분리율이 증가함을 확인하였다. C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis종간 PFGE 형태는 다른 염색체 DNA 형태를 나타내어 종간 분별에 유용한 반면 항진균제 감수성 균주간 차이는 없었다. 항진균제 감수성 시험 결과 칸디다균은 5-flucytosine，fluconazole에 내성을 갖는 균주가 관찰되었으며 5-flucytosine에 대해서는 C. albicans, C. tropicalis, C. krusei종이 주로 확인되었으며 fluconazole에 대해서는 주로 C. glabrata와 C. krusei균주에서 확인되었다. 결국 C. glabrata균주는 fluconazole에 내성을 보이는 경향이 강하며 C. albicans, C. tropicalis는 5-flucytosine 내성을 나타내는 경향이 있는 것으로 확인되었다. C. krusei균종은 fluconazole과 5-flucytosine에 모두 내성을 나타내는 것으로 확인되었으나 오히려 voriconazole 항진균제에 모두 ⫹ 2ug/ml의 MIC를 나타냈다. fluconazole 내성 균주중 C. glabrata균주를 대상으로 내성과 연관된 유전자 발현을 조한 결과 CgCDR1유전자가 CgPDH1유전자보다 더 먼저 약제내성에 관여하는 것으로 확인되었다. 그러나 ERG3과 ERG11유전자는 여러 돌연변이가 확인되었지만 아미노산 치환은 없어 본 연구에서 분리된 내성주의 유전자에 의한 내성 관여는 없는 것으로 확인되었다. RT-PCR을 이용한 감수성 균주간 발현이 증가 혹은 감소한 78개의 유전자가 확인되었고 21개의 유전자는 기능이 확인된 유전자인 반면 57개의 유전자의 단백질 기능은 밝혀진 바 없다. 기능이 확인된 유전자중 involved in cell wall biogenesis, gamma-glutamylphosphate reductase, acetyl-CoA synthetase 등의 유전자는 발현이 증가한 반면 DNA dependent ATPase/DNA helicase B, RIB1 GTP cyclohydrolase II 관련 유전자 발현은 감소하였다. 결론 : 전국에서 분리된 칸디다 균종의 분리빈도 분석 결과 non-albicans 칸디다 균종 분리율이 증가하고 있음을 확인하였으며 항진균제에 내성을 보이는 균종은 적지만 azole계에 대해 C. glabrata종은 C. krusei종과 더불어 높은 MIC를 나타냈다. C. glabrata 감수성 균주간 발현이 증가 혹은 감소한 78개의 유전자가 확인되어 현재까지 알려진 내성 관련 유전자 외에 여러 유전자가 직, 간접으로 내성에 관여할 것으로 사료됨.

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