Bacteroides fragilis의 독소유전자 분석 및 재조합독소 발현에 관한 연구

초록

목적 : 국내에서는 enterotoxigenic B. fragilis(ETBF)에 의한 감염 및 장독소유전자에 대한 연구가 전무한 바 국내 종합병원에 내원한 환자에서 분리된 균주의 장독소 생산여부와 정제된 장독소의 생화학적 및 분자생물학적 특성을 규명하고 재조합 장독소를 대장균에서 대량 발현하여 생물학적 활성을 평가하고자 하였다. 방법 : 국내에서 분리된 B. fragilis균주들을 대상으로 PCR법과 세포독성시험을 실시하여 장독소 생산 여부를 조사하였다. ZAP Express Vector kit을 이용하여 genomic library를 제작하고 독소유전자를 probe로 사용하여 독소유전자의 염기서열을 분석하고 독소단백질의 구조를 규명하였다. 또한 ETBF균주 배양 상층액으로부터 hydrophobic 및 ion exchange column을 통과시켜 장독소를 정제한 후 생화학적 특성을 분석하였으며 HT29/C1 세포에서 세포독성을 확인하였다. 독소유전자를 pET26 벡터에 클로닝한 후 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하였다. 발현된 재조합 장독소의 위치 및 면역학적 특성은 SDS-PAGE 및 western blot을 실시하여 분석하였다. 결과 : 국내분리 균주 89주를 대상으로 PCR과 세포독성시험을 실시한 결과 34주의 균주가 ETBF균주였다. 이 중 11개의 균주가 기존에 보고된 장독소 subtype인 bft-1및 bft-2와 구별되는 새로운 isoform의 독소유전자임이 확인되었고 이중 ETBF 419 균주의 배양 상층액에서 정제한 장독소의 분자량은 SDS-PAGE 상에서 약 20KDa 이었으며 western blot 결과 기존에 보고된 subtype의 독소 면역 항혈청과 교차 반응을 보였다. 대장균에서 발현된 ETBF 419 균주의 재조합 장독소에 대해 세포 독성시험과 western blot을 실시한 결과, 전구체 형태의 장독소는 주변세포질에서 하나의 46 kDa 밴드를 확인할 수 있었고 세포배양액에서 독소의 활성을 확인할 수 있었지만 활성 형태의 장독소는 inclusion body로 발현되었으며 세포배양액에서 독소의 활성을 관찰할 수 없었다. 결론 : 국내 임상 가검물에서 분리된 B. fragilis에서 38%의 ETBF 균주가 확인되었으며 기존에 보고된 장독소 유전자 subtype과는 구별되는 염기서열 구조를 갖는 새로운 subtype의 장독소 유전자임이 확인되었다. 또한 대장균에 장독소를 활성 및 전구체의 형태로 발현시킨 결과 장독소가 생물학적인 활성을 갖기 위한 단백질의 folding과 활성 독소의 분비를 위하여 protoxin 상태의 발현이 필수적임을 알 수 있었다 .

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