보툴리눔 독소생물활성 분석 및 고감도 진단법 개발 연구

초록

목적 : 보툴리늄 독소는 Clostridium botulinum에 의해 생산되는 신경독소로 보툴리즘의 원인이 되며, 사람에서는 A-G의 7가지 독소형 중 A, B, E, F의 4가지 독소형이 보툴리즘을 유발한다. 국내의 경우 2003년 A형 보툴리즘이 최초발생한 이래 꾸준히 환자발생이 보고되고 있으나, 진단표준품 부족으로 신속한 진단이 어려운 실정이다. 따라서 본 연구에서는 보툴리눔 독소형에 대한 기초연구를 수행하고, 표준 항독소 확보 및 새로운 고감도 진단법을 개발하고자 한다. 방법 : 보툴리늄 균주를 수집하여 생리·생화학적, 유전자 및 단백질 수준에서의 분석을 통하여 균동정을 실시하였으며, A, B, E, F 독소형에 대한 multiplex PCR법을 확립하였다. 또한 독소발현 확인을 위한 realtime PCR 및 ELISA법을 개발하여 동정된 균주에 적용하였다. 항독소 생산용 항·원 확보를 위한 최적의 정제법 확립을 위하여 다양한 방법의 독소정제 프로토콜을 이용하여 A, B, E형 독소 정제를 시도하였다. 결과 : 균주분석을 통하여 A-F의 6가지 독소형에 대한 균주를 동정·확보하였다. 균등정법으로는 16s rRNA sequencing, multiplex PCR, 마우스 독성검사가 유용하였으며, 특히 multiplx PCR은 A, B, E, F 독소형에 대하여 각각 서로 다른 크기의 유전자를 증폭함(672, 457，266 및 543 bp)으로써 독소형 확인도 가능하였다. Realtime PCR과 ELISA를 이용하여 mRNA 및 단백질 수준에서의 독소발현을 확인한 결과 late exponential phase에서 보툴리능 독소발현이 최대값을 나타내었다. 독소정제를 실시한 결과 발효조 배양, 황산 및 ammonium sulfate 침전을 혼합한 정제법이 효과적이었다. 결론 : 본 연구는 보툴리늄 동정법 확립을 통한 균주확보, 독소발현량 측정법 개발 및 독소정제법 확립을 통하여 보툴리늄 진단을 위한 항독소 생산 및 새로운 고감도 진단법을 개발하기 위한 기초를 마련하였다는 데 의의가 있다.

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