Genome 분석 기술개발 및 표준화 체계 확립에 관한 연구 : 인간 유전자 확보 및 이를 이용한 cDNA Chip 제작

초록

목적 : cDNA chip 실험 및 분석기술 표준화, 이를 통한 각 질환센터의 기술 지원, 7,000개 인간유전자의 조직별·기능별 분류 및 database 구축, 다량의 확보된 clone을 slide에 고밀도 집적시키는 기술을 확립한다. 방법 : chip 실험 및 분석 표준화를 위하여 Tri-reagent을 이용하여 total RNA 추출, cDNA 합성, labeling, chip hybridization, scanning, image processing, 및 datamining을 하였다. 국내외 연구소 및 질환센터로부터 clone 확보를 위하여 협조를 요청하였다. 확보된 인가 유전자의 annotation 및 datamining을 위하여 대부분의 유전자 기능이 밝혀진 yeast genome과 비교를 통한 유전자 기능을 분류하였다. 또한 NCBI Unigene database를 근거로 유전자 조직발현 여부를 조사하였다. 양질의 고밀도 chip 제작을 위하여 확보된 유전자의 PCR, 전기영동, PCR purification, DNA 정량을 행하였다. 아울러 양질의 spot quality를 위하여 spotting 될 clone의 DNA 농도, pin의 높이, prespotting 횟수, pin washing 조건, spotting solution 종류등 다양한 조건을 이용하여 표준화하였다. 질환센터 기술지원 및 협력을 위해 해당연구자들에 대하여 표준화된 DNA chip 실험 전반에 관하여 교육을 실시하였다. 결과 : DNA chip 실험 효율성을 높이기 위하여 기존에는 보통 50-60㎍의 total RNA가 필요했으나 indirect labeling 및 hybridization 방법을 도입 개선하여 10-15㎍ total RNA로 양질의 결과를 얻을 수 있었다. 또한 Imagine 및 Genesight 프로그램을 이용하여 image processing, normalization, clustering둥 다양한 분석기술을 표준화 하였다. Genomic tree사로부터 500여개의 인간유전자 및 chip 분석에 필요한 positive 및 negative control clone를 추가 확보하였다. 확보된 인간유전자를 기능별로 80가지의 functional category로 분류를 하였고, 조직별로는 NCBI Unigene database를 바탕으로 93가지 tissue category로 분류하였다. 이들 정보를 이용하여 Human clone database를 만들어 국립보건원 유전체연구소 웹 기반으로 구축하였다. 양질의 chip clone 보유를 위하여 다양한 PCR 조건을 이용하여 확보된 인간유전자중 2.5% PCR error을 갖는 clone quality를 확보하였다. chip printing 및 slide processing 표준화를 위하여 superamine slide을 이용하여 다음과 같은 조건을 확립하여 8K human chip을 제작하였다: telechem spotting solution, -1.0 mm pin height, 10번의 prespotting, 200-500 ng/ul DNA, 2시간 80도시 slide baking. 12개 질환센터중 폐 및 호흡기 질환센터 박 춘식 박사, 면역질환센터 전 창덕 박사, 조혈계질환센터 김 형준 박사, 심혈관계질환센터 배 윤수 박사등 세부책임 연구자와 협력 을 통하여 표준화된 DNA chip 실험 및 분석기술을 전수하였다. 국립보건원 유전체연구소 단백체팀 곽 규범 박 사와 협력을 통한 인간 세포인 THP-1 에 CD54 처리에 의한 mRNA 와 단백체 관계조사를 위한 chip 협력실험 을 하여 대한 분자세포생물학회에 발표하였다. 결론 : 국가기관인 국립보건원 유전체연구소가 human chip을 보유함으로 경제적으로 고가인 chip 때문에 실험을 수행할 수 없거나, 실험 및 분석기술부족으로 인하여 chip 실험에 난황을 겪고 있는 각 질환센터 및 타 연구기관에 표준화된 chip 기술을 이전 할 수 있게 되어 국내 보건연구에 크게 이바지 할 수 있을 것이다. human clone database를 앞으로 추가 보완 및 chip 실험 결과를 아울러 추가함으로 각종 난치성 질병의 진단, 예방, 치유에 큰 도움이 될 것이다.

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