프로테옴 분석으로 확인된 폐렴구균의 GrpE 단백의 기능유전체학적 접근

초록

목적 : 폐렴구균의 스트레스 반응에 대한 프로테옴 분석을 통해 발굴한 GrpE 단백의 특성 및 기능 규명과 스트레스하에서 GrpE의 방어기전 및 병원성과의 관련성 여부를 규명하기 위하여 다양한 스트레스별 GrpE 단백의 발현 양상 분석을 실시하고 grpE mutant를 제작하고자 하였다. 방법 : GrpE 단백의 발현은 real-time PCR을 이용한 grpE 전사체의 정량 분석을 통해 실시하였다. 스트레스를 처리한 폐렴구균에서 총 RNA를 추출한 후 Superscript Ⅱ reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성하여 template로 사용하였다. Primer express 2.0 software(ABI)를 이용하여 고안한 특이적인 primer 및 probe를 사용하여 TaqMan probe 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 한편, grpE mutant는 triple-joining PCR ligation mutagenesis 방법을 응용하여 제작하였으며, 먼저 grpE 유전자 일부와 erythromycin 내성 유전자를 포함하는 insert DNA를 triple-joining PCR을 통하여 확보하였다. 이들 PCR 산물은 S. pneumoniae Rx1과 D39 균주에 형질전환시켜 erythromycin이 함유된 CTA plate에서 도말하여 배양된 집락을 1차 선별하였다. 결과 : 전년도 사업을 통해 확보한 anti-rGrpE polyclonal antiserum을 이용한 immunoblotting 결과 GrpE 단백항원과의 반응 특이성을 확인하여 이를 grpE mutant 제작 과정 및 향후 실험에 사용하고자 하였다. GrpE 단백의 발현은 42℃로 15분 heat shock 처 리 시 2차원 전기영동과 RT-PCR 모두에서 발현 증가가 확인되었다. 반면, 2mM H₂O₂ 30분 처리 시에는 2차원 전기영동에서는 발현 감소, RT-PCR로는 발현 증가가 확인되어 일치되지 않는 결과를 보였으며 이에 대한 추후 실험을 진행할 예정이다. 한편, GrpE 단백질의 생리활성 기능 규명을 위해 grpE 유전자가 결여된 mutant를 triple-joining PCR ligation mutagenesis법으로 제작하였다. Mutant 제작 시 외부 유전자 삽입을 확인하기 위한 표식 유전자로 S. pneumoniae KNIH1156 유래 erythromycin 내성 유전자인 ermB 유전자를 확보하였다. 먼저, grpE 유전자의 5' 말단과 3' 말단 부위가 포함되도록 증폭한 left arm과 right arm 및 ermB gene을 template로 triple-joining PCR을 실시하여 grpE::ermB construct를 제작하였다. 이를 highly transformable S. pneumoniae Rx-1 균주와 D39 균주에 CaCl₂와 competence stimulating peptide인 CPS-1으로 형질전환한 후 erythromycin 함유 선택배지에 도말하여 증식된 균주를 분리하였다. 이들로부터 Rx-1 균주 유래 ∆grpE mutant 9주(no. 1~9)와 D39 균주 유래 ∆grpE mutant 1주(no. 1)를 분리하여 확보하였으며, 최종 균주 선정을 위한 일련의 확인 실험을 진행할 예정이다. 결론 : 본 2차년도에는 폐렴구균에서 스트레스하에서 GrpE 단백질의 발현 양상을 분석하는 한편, grpE mutant를 제작함으로써 앞으로 GrpE 단백질의 생리활성기능 규명 및 병원성 인자와의 관련성 연구를 수행하고자 한다.

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