장내바이러스 게놈 분석을 통한 병원성 결정 인자와 세포내 증식 억제 기작 규명 및 응용에 관한 연구

초록

목적 : 장내바이러스의 유전자 특성 분석을 통한 질환의 진단법 및 치료방향 제시와 효율적인 예방기술 확립을 위하여 바이러스의 감염 메커니즘 파악 및 질병발생 원인체의 유전정보 분석을 통한 생물학적 특징의 이해를 시도하였다. 국내에서 분리된 다양한 장내바이러스의 확보와 전체 유전자 분석 및 infectious cDNA 제작기법 확립 및 chimeric 바이러스 제작을 통하여 Coxsackievirus B3와 같이 심근염 등의 문제를 야기하는 주 요 장내바이러스의 병원성에 중요한 영향을 미치는 병원성 결정인자를 규명하고자 하였다. 또한 장내바이러스 단백질 분해효소 기능 연구를 통한 장내바이러스성 질환의 예방 및 치료분야에 대한 기초자료 확보를 통하여 장내바이러스 전체 유전자 정보 자료로부터 신속, 정확하게 질병을 진단할 수 있는 진단방법의 실용화를 위한 기반조성에 그 목적이 있다. 방법 : 국내분리 장내바이러스의 지속적 확보 및 주요 분리주의 전체 게놈 분석을 위한 유전자 클로닝을 수행하였다. 확장성 심근염(dilated myocarditis) 원인 바이러스인 Coxsackievirus B3(CVB3)의 심장독력 병인론 규명을 위하여 바이러스 감염 능력을 결정하는 요인으로 알려진 리보소옴 부착부위(ERES ; internal ribosomal entty site) 의 2차원적 구조 분석 및 inter-strain chimeric 바이러스 제작을 통하여 IRES 구조 변화가 바이러스 증식에 미치는 영향을 분석하였다. 동시에 국내에서 분리된 장내바이러스의 유전자를 클로닝하여 단백질 분해효소를 발현 한 후 활성 측정 체계 구축을 위한 in vitro 검색체계에 사용하고자 하였다. 결과 : 국내 분리 장내바이러스의 전체 게놈 확보를 위하여 24가지 장내바이러스 분리 및 동정을 완료하였으며, 장내바이러스 IRES를 포함한 5‘NCR 유전자를 다수 확보하였다. 장내바이러스성 질환의 정확한 진단법 확립에 기초가 되는 standard RNA 개발을 위하여 외래 유전자로부터 standard cDNA를 클로닝하였으며, in vitro transcription을 통한 standard RNA의 대량 생산 투 standard RNA의 RT-PCR 검줄한계 분석한 결과 5-10ng의 바이러스 유전자를 검출할 때 target 유전자의 증폭기작에 영향을 미치지 않으면서 정확한 standard band가 증폭됨을 확인하였다. 심근염 유발 바이러스(CVB3)의 병인론 규명을 위하여 이미 CVB3-97/Kor 전체염기서열 분석 및 cDNA 클로닝은 완료하였으며, 심장 병원성을 가지는 CVB3-Nancy 전체 cDNA 클로닝을 수행하여 심장병원성을 다시 한번 확인하였다. 감염성 cDNA를 transfection 하여 얻어진 progeny virus의 특성분석 을 통하여 동일한 바이러스가 유도되었음을 확인하였다. 장내바이러스 단백질 분해효소 클로닝 및 기능 탐색을 위한 과정으로 장내바이러스 단백질 분해효소 유전자 클로닝 및 원핵생물체계에서 발현 성공 후 M-NTA agarose를 통하여 발현 단백질을 정제한 결과 정확한 크기의 단백질 분해효소가 발현을 확인할 수 있었다. 결론 :국내 분리 CVB3(CVB3-97/Kor) 및 CVB-Nancy주(원형주) 의 전체 유전자를 분석하고 감염성 cDNA를 성공적으로 클로닝하여 progeny 바이러스의 생산 능력이 있음을 확인하였다. 이는 심장독성을 내타내 는 유전인자를 밝히기 위한 본 연구에 필수적인 중요한 연구재료를 확보하였음을 의미하며, chimeric virus의 제작에 중요한 IRES 유전자 클론 등 중요 연구재료를 확보함으로써 장내바이러스의 병원성 결정인자 규명을 위한 기반을 마련하였다. 또한 장내바이러스 단백질 분해효소를 성공적으로 발현함으로써 바이러스성 질환 치료 제 개발에 중요한 기초기술을 확보하였다.

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