탄저균의 유전체 분석 및 기능성 게놈연구

초록

목적 : 숙주반응기작 및 탄저균의 병인기작에 관련된 중요 유전자를 동정하기 위하여 고병원성 탄저균 포자를 mouse macrophage cell line 감염시킨 푸 시간별로 RNA를 분리하고 mouse DNA chip에 반응시켜 포자 감염에 따른 시간별 숙주유전자의 변화를 관찰하고자 함. 또한 공초점레이저현미경을 이용하여 탄저포자의 감염시간별 세포 및 포자의 변화양상 을 관찰함으로써 세포감염과정의 형태학적 연구토대를 구축고자 함. 방법 : Bacillus anthracis ATCC 14578 (pXO1+, pXO2+) 포자를 mouse macrophage cell line에 감염 후 0, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 간격으로 total RNA를 분리한 후 QC과정을 거쳐 시료상태를 확인한 후 cDNA를 합성함. In vitro transcription과정 을 거쳐 target을 labeling하여 42℃에서 hybridization을 진행함. GenePix, ImaGene등을 이용하여 각 유전자의 발현 수준을 정량화 하고 2배 이상의 발현차이를 보이는 유전자를 분류함. 공초점레이저현미경 관찰을 위해 포자를 세포에 감염시킨 후 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 9시간대에서 시료를 고정하고 포자 및 capsule에 대한 항체와 Lysosome marker인 LAMP-1 단백질 항체 등을 fluorescence가 conjugation 되어 있는 2차 항체로 반응시킨 후 적절한 파장에서 공초점레이저현미경을 사용하여 관찰함. 결과 : 각 시간대별 발현양상을 분석한 결과 감염초기단계에서 변화를 보이는 발아관련 유전자를 탐색하기 위하여 1시간동안 15분 간격으로 시료를 분리하여 분석한 결과 유사한 패턴을 나타냈으며 45분, 1시간, 2시간, 3시간에서는 1,000개정도의 유전자가 2배 이상 발현변화를 보이는 것으로 나타났음. 한 시간대에 2배이상 조절된 유전자를 대상으로 ontology 및 pathway분석한 결과 G-protein coupled receptor protein signalling, JNK cascade, protein kinase, cellular morphogenesis 관련 pathway의 유전자들이 변화된 발현 양상을 보이는 것으로 분석됨. 또한 공초점레이저현미경을 이용하여 탄저포자 감염후 세포 내 변화를 관찰한 결과포자의 phagocytosis후 lysosomal fusion을 확인 할 수 있었으며 9시간대까지 cell lysis가 일어나지 않음을 확인함. 결론 : Microarray 1차 실험결과는 추가실험을 통해 재현성을 확인하고 통계처리 값 (p-value)과 발현차이 값을 기준으로 유전자 선별 및 유전체분석을 진행하고 함. 또한 공초 점현미경을 이용한 관찰결과는 포자감염후 6시간정도에 mouse cell line이 lysis된다는 연구결과와 차이가 있으며 향후 cell lysis가 일어나는 시간을 확인하여 관찰조건을 확립함으로써 탄저포자중화항체나 포자발아저해제와 같은 약물 등의 효능을 평가하는 연구도구로도 활용할 계획임.

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