유전체 분석법을 이용한 코로나19 치료후보 물질 탐색 및 효능평가 연구

초록

ㅁ 연구목표 ㅇ SARS-CoV-2 및 새롭게 출현하는 바이러스에 효율적으로 적용할 수 있는 치료후보 물질을 확보하고자 BI (Bioinformatics:생물정보학) 분석기반 치료 후보물질 발굴 ㅁ 연구내용 및 결과 (1차년) 코로나19 바이러스 유전체의 In silico 분석에 의한 치료후보물질 탐색 내용 1) 치료후보물질 발굴을 위한 코로나19 RNA virus 구조 특성 탐색 및 In silico 분석에 의한 치료후보물질 분석 및 검증 ① 코로나19 바이러스 RNA의 2차구조 모델링 결과 1) 코로나19 바이러스 유전자의 RNA 2차구조 모델링 및 후보물질 탐색 ① 코로나19 확진자 멀티오믹스 데이터 생산 및 자원화‘ 공개자원 분양 - 오믹스 정보(COVIDseq 279건) - scRNAseq 83건 코로나19 확진자 69건 ,일반인 14건 - 임상역학정보(NBK-D20-E)(297건) ② 코로나19 변이바이러스 RNA의 2차구조 모델링 - 276개 시퀀스에서 90%~100%의 consensus sequence를 추출 - conserved region과의 일치하는 영역 추출,5’UTR,FSE(frameshiftelement), 3’UTRregion확보 ③ RNALigands의 PDB와 Inforna database에서 2차구조 모티프 결합 small molecule와 ligands 13종 이상 획득 내용 2) 치료후보물질의 SARS-CoV-2 감염 세포에서의 효과능 분석 ① 세포독성 및 항바이러스 활성 측정(In vitro) 결과 2) Vero세포에서의 EZ-CYTOX 이용 살아있는 세포 양 측정 및 Crystal violet 이용한 항바이러스 효과 측정 ① 12종의 후보물질의 CC50(세포독성) 및 TCID50(바이러스억제) 측정 ② Vero 세포에서 바이러스 감염에 의해 세포가 사멸한(cytopathic effect :CPE) 측정, 1종의 세포의 바이러스 감염을 저해하는 후보물질 선별 ③ 1종 후보물질의 바이러스 감염 저해단계 확인을 위한 TCID 측정 (2차년) 코로나19 바이러스 감염환자 임상검체의 유전자 발현양상의 In silico 분석에 의한 치료후보물질 탐색(scRMA-seq. 기반) 내용 1) scRNA-seq 자료에 기반한 약물재창출 후보 물질 탐색 ① 감염 임상검체 이용 RNA-seq. 분석을 통한 SARS-CoV-2 related gene sets 확보 ② 세분화된 세포 clustering 및 annotation DEG분석, 각 그룹별 세포별 gene symbol 선택 ③ 허브유전자를 얻기 위한 GSEA 결과 1) 정상인과 COVID-19간 차등발현된 유전자 목록으로 GSEA 분석 ① 각 면역세포의 상대적인 비율 분석결과를 바탕으로 ② Normal vs COVID-19 그룹, CD8+T, CD14 Mono, NK세포 positive, negative 유전자 세트 결정(각 top 5개) ③ CD8+T, CD14 Mono, NK cell 3개 cell type에서 공통적으로 발현된 유전자 목록 (INPUT)을 HUB GENE으로 등록, GSEA 분석을 통해 세 cell type에서 가장 많이 나타나는 유전자 목록 및 GENE SET TERM 결정(15개, 20개) 내용 2) In silico 분석에 의한 치료후보물질 네트워크분석 및 검증 ① 단일세포분석을 통해 정상인과 COVID-19간 차등발현된 유전자 목록으로 IPA 분석 ② COVID-19 환자로부터 확인되는 특이적인 유전자 마커를 중심으로 약물과 유전자간의 상호작용 예측(DRUG-Gene interaction database) 결과 2) CD8+T cell, CD14 Monocyte cell, NK cell IPA 분석을 통해 Top canonical pathway, protein pathway, network 등 파악 ① IPA 분석을 통해 도출된 관심 유전자 목록 선별(13개) ② Connectivity Map을 이용한 약물 스크리닝 및 타겟 유전자에 대한 예측, 각 50개씩 추출 ③ 각 면역세포별 차등 발현유전자를 query로 하여 LINCS 데이터베이스를 통해 drug 및 compound를 확인(35개) ④ Normal vs COVID-19, Mild vs Severe, IPA 허브 유전자를 이용하여 DGIdb(Drug-Gene Interaction db) 선정 후보물질(58개) 내용 3) 치료후보물질의 SARS-CoV-2 감염 세포에서의 효과능 분석 ① 18종 세포독성 및 항바이러스 활성 측정(In vitro) 결과 3) Vero세포에서의 EZ-CYTOX 이용 살아있는 세포 양 측정 및 Crystal violet 이용한 항바이러스 효과 측정 ① 17종 후보물질의 CC50(세포독성) 및 TCID50(바이러스억제) 측정 ② 8종 후보물질의 Vero 세포에서 바이러스 감염에 의해 세포가 사멸한 (cytopathic effect :CPE) 측정 (3차년) 코로나19 바이러스 감염환자 임상검체의 유전자 발현양상의 eQTL분석에 의한 치료후보물질 탐색(scRNA-seq, WGS, cytokine profiling 기반) 내용 1) 다중오믹스 및 코로나19 임상정보를 활용하여 코로나19 환자의 아형 분류하고, 아형과 연관성이 있는 유전자를 발굴 ① 중증도 기반의 sample QC, 유전체 기반 성별 QC, 중증도에 해당하는 시점 선별 ② WGS 자료 전처리, GATK joint-calling tool과 Haplotype caller를 이용하여 총 30,845,052 SNPs과 4,900,623 InDels calling ③ cytokine profiling 자료 전처리 결과 1) ① COVID19의 중증도(NIH기준, WHO기준)와 연관성이 높은 cytokine을 정하기 위해 연관성 분석(수집 차수, 성별, 나이를 공변량을 지정)을 진행하여 NIH 및 WHO 기준 각 10개씩 cytokine 결정 ② sample QC와 SNP QC를 진행하여 최종 609명의 6,237,567 SNP이 QC를 통과 내용 2) cytokine profiling 자료를 이용한 cQTL 분석 ① cytokine profiling 자료 준비 및 전처리 ② WGS를 통해서 마련된 유전체자료의 전처리를 수행하여 SNP 자료를 준비 결과 2) ① 각 중증도별 top10개 cytokines 결정 -123개 유전자와 40개 cytokines 의 2054 SNP 분석 ② grpop3(WHO기준 6,7,9,10)과 group7(WHO 기준 5~10) 으로 분류했을 때 -191 cytokines 그룹핑을 했을때와 하지 않고 분석했을 때 유사한 결과 내용 3) scRNA-seq에 기반한 eQTL 분석 및 ASGARD(A Single-cell Guided Pipeline to Aid Repurposing of Drugs) 치료후보물질 스크리닝 ① ChEMBL 데이터베이스(버전 26)에서 약물과 임상 후보군의 치료 타겟에 대한 정보를 수집. 승인된 약물에 대해 추가적인 잠재적 인간 타겟 단백질 식별, SARS-CoV-2 감염과 관련된 단백질과 COVID-19 관련성 평가, 감염 중 농도 변화, 바이러스 단백질과의 상호작용, 항바이러스 세포 기반 실험에서 약물 활성 등 SARS-CoV-2 감염과 관련된 단백질 선정 ② 대상자 선정을 위해 COVID19 NIH　중증도가 Normal, Severe, Critical에 해당하는 환자를 대상으로 추출, ③ COVID19 약물 후보 물질 탐색을 위한 분석 파이프라인은 ASGARD (A Single-cell Guided Pipeline to Aid Repurposing of Drugs) 파이프라인을 이용. 모든 분석은 R (version 4.4.1)을 이용 - DrInsight(version 0.1.1) 패키지를 이용하여 질병 세포와 정상 세포에서 유전자 발현 패턴을 반전시키는 잠재후보 약물을 식별함. 해당 분석에서는 중증도 Normal에 해당하는 샘플을 정상군, Severe 및 Critical에 해당하는 샘플을 질병군으로 분류 - cell type별 QTL 진행 결과 3) ASGARD 방법을 이용한 약물 후보 탐색 ① ChEMBL 데이터베이스 단백질 선별 - 총 1,263개의 인간 단백질 식별, 승인된 약물의 타겟 531개, 임상 후보 타겟 381개, 그리고 승인된 약물이 결합하지만 치료 타겟으로 명시되지 않은 추가 단백질 351개가 포함 - 총 1,263개의 단백질 중, 300개는 SARS-CoV-2 감염에서 생물학적으로 관련이 있는 것으로 선별, 547개는 COVID-19와 관련이 있을 수 있는 약물 타겟 ② Normal 100명, Severe에 해당하는 49명, Critical에 해당하는 42명 환자의 총 200개 샘플 데이터를 랜덤 추출 ③ B cell, CMP, Erythroblast, Monocyte, NK cell, Platelets, T cell의 7 종류 세포 클러스터가 식별 - 산출된 스코어가 전체 약물 중 상위 1%에 해당하며, FDR 값이 0.05보다 작은 경우에 해당하는 약물을 최종적으로 선택 ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ 현재 유행중이거나, 새롭게 출현하는 바이러스에 효율적으로 적용 할 수 있는 치료물질 탐색법 확립 등을 통해 신변종 바이러스 대응을 위한 관리정책 근거 자료 확보

Purpose and Objective: This study aims to discover potential therapeutic candidates for COVID-19 through drug repurposing network analysis. The research focuses on targeting confirmed molecular pathways related to the COVID-19 outbreak. The objective is to conduct analysis using multi-omics data (single-cell RNA sequencing, whole genome sequencing, and cytokine profiling) collected from COVID-19 patients at various stages of disease severity. The study seeks to identify statistically significant correlations between genetic variants and gene expression, as well as to discover key genes regulating gene expression. Research Contents: ㅇ Structure-based drug repurposing approach targeting conserved RNA elements in the SARS-CoV-2 genome. 11 compounds were evaluated against key RNA structures, identifying riboflavin as a promising antiviral candidate ㅇ Clinical data underwent quality control (QC) to select samples for analysis. ㅇ Conducted downstream quality control of whole genome sequencing (WGS) data, calling approximately 3 million single nucleotide polymorphisms (SNPs). ㅇ For single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and cytokine profiling data, preprocessing steps such as batch effect correction and normalization were performed. ㅇ Cytokine profiling results were used to perform clustering based on similar expression patterns of cytokines. ㅇ Conducted correlation analysis between cytokine profiling results and genomic data. ㅇ Explored drug candidate substances that could inhibit severe progression of COVID-19 using scRNA-seq data and drug databases. Among the candidates, raloxifene, sirolimus, and imatinib have already been proposed in drug repurposing studies and are undergoing clinical trials for COVID-19. Other identified drug candidates that have not yet been studied or clinically tested may be proposed as new treatments for COVID-19 after further functional analysis of the targets. Conclusion: This study not only provides a potential new therapeutic approach for COVID-19 but also establishes a framework for identifying antiviral agents targeting RNA viral genomes. This approach could be applied to other RNA viruses, potentially leading to the development of broad-spectrum antiviral therapies. Other identified drug candidates that have not yet been studied or clinically tested may be proposed as new treatments for COVID-19 after further functional analysis of the targets.