바이러스 감염 진단을 위한 다목적 DNA chip 개발

초록

목적 : 최근 DNA chip을 이용한 microarray 방법의 개발로 한번의 시험에 의해 빠르고 간편하면서 많은 정보를 정확하게 제공할 수 있는 진단 kit 개발이 가능하게 되었다. 이러한 DNA chip을 이용하여 다양한 형태의 진단제 개발이 향후의 진단 방법의 주류를 이룰 것으로 판단되어 가장 효과적이고 다양한 용도의 바이러스 유전자 진단용 DNA chip을 개발하고자 하였다. 방법 : 2차년도 에는 민감도와 특이도를 높이기 위하여 70mer oligonucleotide probe를 고안하여 DNA chip을 제작하였다. DNA chip 제작에 앞서 PCR을 이용한 probe의 사전평가를 dot blot hybridization 실험을 통하여 수행하였다. 각 바이러스에 대한 공통 primer 및 cDNA를 이용하여 일반적인 PCR 방법으로 target 유전자의 증폭을 수행하였으며 증폭된 target 유전자는 amino-modified nucleotides를 포함하도록 하였다. 증폭된 aminoallyl-labelled PCR 산물을 Cy5 monofunctional reactive dye와 반응시키고 probe가 부착된 test용 slide에 hybridization하였다. Microarray 결과 판독은 아질런트사의 microarray scanner를 사용하여 수행하였다. 결과 : 효율적인 DNA chip 제작을 위하여 dot blot hybridization에 위해 targetᅳ-probe의 민감도 및 특이도를 검색한 결과, 7 serotype echovirus에서 같은 농도의 25mer probe와 70mer probe를 시용 시 70mer probe의 민감도가 더 높음을 알 수 있었으며, 70mer probe는 0.1pmole/ul의 농도에서도 target DNA와 반응하였다. Echovirus(E6, 7, 9，11，13, 25, 30), Hantavirus(Hantaan, Seoul, Puumala), Respiratory viruses(respiratory syncytial virus A, B, parainfluenza virus 1, 2, 3, human coronavirus 229E, OC43, SARS-coronavirus)의 유전형을 확인할 수 있는 DNA chip을 제작하여 각각f 종류에 속하는 표준(reference)바이러스를 이용하여 DNA chip 검사를 시행하였다. 실험에 사용한 표준바이러스 시료 모두 양성으로 나타났고, 또한 chip 상에 나타난 유전형 또한 표준바이러스 유전형과 일치한 결과를 보여주었다. 표준바이러스를 이용하여 DNA chip을 검증하였고 3회 반복실험을 통하여 재현성을 조사하였다. 결론 : Dot blot을 이용한 probe-target 효능분석은 chip 제작의 선행단계의 응용뿐만 아니라 dot blot 자체로도 바이러스의 type specific 감별진단제로 응용 개발할 수 있을 것이다. 또한 2004년도에는 echovirus, hantavirus, 호흡기 바이러스 진단을 위한 DNA chip을 개발하였으며 이를 이용하여 표준 균주 에서 혈청형에 따른 감별진단이 가능함을 확인하였으며, 이를 통해 차기년도에는 DNA chip이 지향하는 one step 진단이 가능한 다목적 진단제 개발 조건을 확보할 것이다.

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