프로테옴 분석으로 확인된 폐렴구균의 GrpE 단백의 기능유전체학적 접근

초록

목적 : 폐렴구균의 스트레스 반응에 대한 프로테옴 분석을 통해 발굴한 GrpE 단백의 특성 및 기능 규명과 함께 스트레스하에서 GrpE의 방어기전 및 병원성과의 관련성 여부를 밝히고자 하였다. 방법 : 외부환경의 변화에 따른 GrpE 관련 유전자들의 mRNA 발현량을 real-time RT-PCR 기법을 이용한 상대 정량법으로 분석하였다. GrpE의 생리활성 기능 규명을 위하여 폐렴구균에서 triple-joining PCR법을 이용한 insertion deletion mutagenesis 방법으 로 grpE::ermB mutant를 제작하였고，wild type과 mutant간 표현형 비교 분석 및 환경 스트레스하에서의 반응의 차이를 분석하였으며 동물모델을 통한 GrpE 단백질의 질병 유발과의 관련성을 확인하고자 하였다. 결과 : 폐렴구균에서 dnaK operon상의 유전자인 hrcA, dnaK, dnaJ, grpE의 mRNA 발 현량은 열 충격(42°C)에 의해 급격한 증가가 확인되었으며， H₂O₂(2mM) 처리의 경우에는 5분 경과 시 발현 증가를 보이다가 그 후 빠르게 발현량의 감소를 확인하였다. 이를 통해 폐렴구균에서 dnaK operon은 열 충격 뿐 아니라 산화적 스트레스의 초기 과정에 관여하지만 스트레스별로 서로 다른 조절 기작이 관여할 것으로 추정되었다. Triple-joining PCR ligation 법으로 제작한 grpE::ermB construct를 highly transformable S. pneumoniae Rx-1 균주에 형질전환시켜 grpE mutant를 제작하였고 PCR법 및 anti-GrpE antiserum을 이용하여 grpE 결실 여부를 최종 확인하였다. grpE mutant는 wild type에 비해 2시간 정도 성장 속도의 지연을 보였으나 전반적으로 유사한 성장 곡선을 보였다. 환경 스트레스하에서 wild type과 mutant의 생존능 비교를 실시한 결과，wild type 균주에 비해 grpE mutant가 열 충격 및 H₂O₂에 대한 감수성이 높게 나타났다. GrpE 단백질이 결여된 돌연변이주는 wild type에 비해 동물모델에서 60% 정도의 독력이 감소하였다. 폐렴구균의 병원성 인자로 알려진 cbpA， ply, psaA， pspA를 대상으로 wild type 균주와 grpE mutant간의 발현 차이를 분석한 결과 wild type보다 mutant 균주에서 ply와 psaA mRNA 발현량이 증가하였으며， cbpA나 pspA의 경우는 발현량의 변화가 없었다. 결론 : 폐렴구균의 GrpE 단백은 외부 환경 인자에 의한 스트레스 반응 과정에 관여하며 단순한 molecular chaperone으로서의 역할 뿐 아니라 광범위한 대사 작용에 관련하고， 폐렴구균의 질병 유발 과정에 관련함을 확인할 수 있었다.

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