코로나19 신규 변이 대비 광범위 중화항체 효능 평가 체계 구축

초록

ㅁ 연구목표 ㅇ 코로나19 신규변이 대비 중화능 평가 플랫폼 구축 및 치료 항체 개발 ㅁ 연구내용 및 결과 1. 코로나19 항체 중화능 평가법 구축 ◈ 본 연구에서는 슈도바이러스기반 중화효능평가 시스템 구축하고 대조물질 (시판 코로나19항체치료제)을 확보하여 SARS CoV -2 변이에 신속 대응 할 수 있는 평가 플랫폼을 마련하였음 ○ 슈도바이러스를 이용한 항체치료제 중화효능 평가법 확립 - 변이주 spike 유전자, 슈도바이러스제작 패키지벡터, 발현 벡터 등을 확보하여 슈도바이러스를 제작함 - 슈도바이러스 발현조건 최적화, 대량생산하여 역가 확인 및 감염성을 확인하는 등 평가법을 최적화하였음 - 평가법의 유효성 확인을 위해 중화능보유 항체를 이용하여 PRNT와 비교한 결과 유사한 것으로 확인됨 - 이를 통해 슈도바이러스 중화효능평가법 구축 및 적용가능성을 확인함 ○ 신속대량스크리닝시스템(HTS) 기반 중화효능 평가법 비교 - PRNT와 HTS 방법에 따른 항체치료제 중화능(IC50) 값을 비교 분석한 결과, PRNT(95.22 ng/ml)와 HTS(105.9 ng/ml) 방법의 차이가 거의 없음. - 신속하게 대량으로 스크리닝할수 있는 HTS방법을 항체중화능 평가에도 적용할수 있음을 확인함 ○ 시판 코로나19 항체치료제 확보 - 시판 코로나19 항체치료제의 유전자를 확보하여 발현 벡터를 제작하고 과발현 조건을 최적화하여 대량 확보하였음 - 변이바이러스에 대한 제작확보된 시판 항체치료제의 중화효능을 평가하고 기존 보고된 결과와 유사함을 확인하였음 - 중화효능 평가법의 대조물로로 시판 항체치료제를 확보하고 평가시스템 기반을 마련함 2. 신규변이대비 항체치료후보물질 중화능 개선 ◈ 본 연구에서는 SARS CoV -2의 지속변이에 따른 항체치료제의 효능감소에 대응하기 위해, 서로 다른 에피톱을 대상으로하는 항체 2종*을 병합요법, 흡입형 개발을 위한 Isotype 변경, 이중항체 플랫폼에 적용하여 개발 및 효능평가를 수행함 * 선행과제를 통해 감염환자 PBMC에서 발굴 및 중화능 확인된 항체(D,I) ◈ 연구결과 단일항체적용에 비해 광범위하게 중화효능이 개선되었으며 특히 이중항체에 대해 높은 효과가 확임됨. 이를 통해 변이바이러스에 대응 가능한 항체치료제 개발 및 신종감염병에 신속대응할수 있는 기반을 마련하였음 ○ 파지 디스플레이기반 발굴 항체 효능평가 - 선행과제를 통해 파지 디스플레이 기반으로 발굴된 항체 18종에 대해스크리닝을 실시하고 최종 항체3종을 선별함(#4, #11, #38) - 항체 3종은 세포효능평가에서 델타형 변이주에 대한 매우 높은 중화효능이 확인되었으나, 동물효능평가에서는 치료 효능이 없었음 ○ 자체발굴 항체2종 특성분석 - 기타코로나바이러스에 대한 교차반응은 나타나지 않았음 - SPR 및 인공지능 구조분석 프로그램을 통한 결합력 분석 결과 두 항체는 비경쟁적으로 서로 다른 에피톱에 결합할것으로 예측되었음 ○ 항체(IgG) 병합요법 효능평가 - 세포효능평가에서 D항체는 BA.5와 XBB1.5에 I항체는 BA.2에 효능을 나타내므로, 두 항체 병합사용시 변이에 상호보완됨을 확인하였음 - 동물모델을 이용한 치료효능 평가에서도 세포실험결과와 유사하게 병합사용시 단독에 비해 변이주에 광범위하게 치료효과를 나타내었음 - 평가결과는 항체 2종이 서로 다른 에피톱을 대상으로 결합할 것이라는 SPR 및 구조분석 결과와 일치함 ○ 항체 Isotype(IgG -IgA) 변경 효능평가 - IgG 항체는 IgA형태로 변경 및 단량체 2종(D.A2, I.A1)과 이량체 1종(D.dA2)으로 발굴함 - IgA 항체는 변이항원(S1)에 대해 높은 친화도를 나타냈으며, isotype 변경에 따른 차이는 나타나지 않음 - 세포효능평가에서 병합처리시 중화 효능을 상호보완하였으며, IgG 결과와 비교하여 유사하거나 약간 더 높은 중화효능을 나타내었음 - 동물모델 평가 결과 항체의 농도 및 치료제 투여 후 경과일수가 높음에 따라 더 높은 치료 효능이 나타나며, 병합시 치료 효능이 상호보완됨 - 효능평가 결과 전체적으로 IgG 결과와 유사하였음 ○ 이중항체 (IgG scFv, Tandem scFv -Fc) 효능평가 - 항체 2종의 가변부위를 결합한 이중항체 2종 (IgG scFv, TandemscFv -Fc)을 제작 및 확보하였음 - 이중항체는 야생형 항원에 대해 높은 친화도를 나타냈으며, IgG D항체와는 비경쟁적 결합, IgG I항체와는 경쟁적으로 결합함을 확인하였음 - 세포효능평가에서는 단일항체에 비해 중화능이 개선되었으며, 동물모델평가에서도 농도 및 치료제 투여 후 경과일수가 높음에 따라 더 높은 치료효능을 나타냈음 - 전체적으로 이중항체는 IgG 단일, 병합처리, IgA 항체보다 더 높은 중화효능을 나타내었으며 특히 Tandem scFv -Fc 형태가 가장 중화효능이 높았음 ㅁ 기대효과 및 활용방안 ○ 코로나19 변이 바이러스 지속출현에 따라 BL2기반 슈도바이러스 중화효능 평가 플랫폼 구축으로 신속하고 안전한 항체치료제 효능평가에 활용 ○ 연구에 적용된 다양한 항체개발플랫폼들은 광범위 치료제 개발 연구에 활용 및 국가 위기대응 연구 기반을 강화 ○ 신종 바이러스 감염병 신속대응을 위한 치료제 개발 연구에 활용하여 국가 보건안보에 기여

Establishment of a Neutralization Potency Evaluation Platform for COVID-19 Antibodies ◈ Objective: To establish a rapid and safe assessment platform to evaluate the neutralizing efficacy of therapeutic antibodies against emerging SARS-CoV-2 variants using a pseudovirus-based system. ○ Development of Pseudovirus-Based Neutralization Evaluation System To evaluate the neutralizing efficacy of therapeutic antibodies against emerging SARS-CoV-2 variants, we developed a pseudovirus-based neutralization assay. Production conditions were optimized to ensure high-yield generation of pseudoviruses. Viral titer and infectivity were systematically assessed to confirm assay reliability. Performance validation was conducted by comparing our pseudovirus-based assay platform to a widely utilized plaque reduction neutralization test (PRNT), affirming its applicability. ○ Comparison of High-Throughput Screening (HTS) and PRNT Methods for Neutralization Assays HTS (105.9 ng/ml) and PRNT (95.22 ng/ml) yielded nearly identical IC50 values, indicating HTS’s suitability for large-scale neutralization screening. This system allows for rapid and efficient evaluation of antibody candidates against novel variants. ○ Securing Commercially Available COVID-19 Therapeutic Antibodies Commercial antibodies were obtained by inserting antibody gene sequences into expression vectors and subsequently overexpressing them in animal cells. The neutralization potency of these antibodies against variant strains was assessed, confirming their effectiveness relative to previously reported results. These therapeutic antibodies served as controls in the validation of the neutralization evaluation platform. Enhancement of Neutralization Potency Against Emerging Variants Through Novel Antibody Development ◈ Objective: To develop a novel antibody platform targeting diverse epitopes to address the diminished efficacy of existing monoclonal antibodies against novel variants. ○ Efficacy Evaluation of Antibodies Discovered Using Phage Display Eighteen antibodies were screened using phage display technology, and three promising candidates (#4, #11, #38) were selected for further evaluation. These antibodies demonstrated high neutralization potency against the Delta variant in cell-based assays but were less effective in animal models. ○ Development of IgG Antibody Cocktail Therapy The efficacy of two different antibodies (IgG-D, IgG-I) targeting distinct epitopes was evaluated individually and in combination. In cell-based assays, the combination therapy exhibited excellent neutralizing activity against BA.5, XBB.1.5, and BA.2 variants. The therapeutic efficacy of the antibodies was validated in a mouse model, with the combination providing broader protection than the monoclonal antibodies alone. SPR and AI structural analysis predicted noncompetitive binding to different epitopes. ○ Discovery of Inhaled Antibodies by Switching (IgG to IgA) Intravenous IgG antibodies were converted to inhaled IgA forms (D.A2, I.A1, and D.dA2), and the neutralization efficiencies of these generated antibodies were compared. IgA antibodies exhibited enhanced binding affinity to the spike protein and demonstrated comparable or superior neutralization activity compared to IgG antibodies. In animal studies, IgA antibodies showed improved therapeutic efficacy when administered in combination, highlighting the potential of isotype switching in therapeutic development. ○ Development and Evaluation of Bispecific Antibody (IgG scFv, Tandem scFv-Fc) Bispecific antibodies (IgG scFv, Tandem scFv-Fc), composed of variable regions of two different antibodies (IgG-D, IgG-I), were developed to target both wild-type and mutant strains. Bispecific antibodies exhibited higher neutralizing efficacy than IgG antibodies alone or in combination. Notably, the Tandem scFv-Fc construct showed the highest therapeutic efficacy in both cell-based and animal model evaluations. These results suggest that bispecific antibody platforms offer a promising strategy for countering evolving viral variants. Conclusion and Future Directions - The pseudovirus-based neutralization assay platform is a valuable tool for the rapid and safe evaluation of antibody therapeutics against SARS-CoV-2 variants. - This study highlights the effectiveness of antibody cocktails, isotype switching, and bispecific antibody therapies in countering SARS-CoV-2 variant resistance. - Contributing to the development of next-generation therapeutic antibodies, it lays the foundation for rapid responses to emerging infectious diseases, enhancing national health security.