Ciprofloxacin 내성 임균의 non-target site 변이 내성기작 규명

초록

목적 : 임균의 치료제로 널리 사용되던 ciprofloxacin등 fluoroquinolone계 항균제에 내성을 갖는 임균이 최근 급속하게 증가되었다. 내성 발현은 향균제 작용부위인 gyrase A, topoisomerase Ⅳ의 돌연변이에 의한 것으로 알려져 있지만 같은 양상의 돌연변이를 갖는 균도 다양한 MIC값을 나타냄으로서 efflux pump 또는 porin 발현양 조절 등의 다른 내성 기작을 가질 것으로 의심되어 이를 규명하고자 하였다. 방법 : 임균의 내성유도를 위해 단계적으로 ciprofloxacin의 농도를 증가시켜 내성주를 screening하였다. 항균제 감수성시험은 NCCLS 방법을 따라 수행하였고 염기서열분석은 증폭된 PCR 산물을 direct sequencing하였다. OMP는 Sarkosyl법으로 분리하였고 이를 SDS-PAGE와 2-Dimensional Electrophoresis(2-DE)로 분석하였다. 결과 : 내성을 유도한 76, 92번 균주에 대해 ciprofloxacin MIC값이 각각 7배, 11배 증가된 내성 유도 주를 얻었고 이를 여러 계열의 항균제에 대해 감수성 시험한 결과 ciprofloxacin이외에도 76번 계열은 PE, TE등에, 92번 계열은 TE, AZ등에 감수성이 저하되었다. 92번 내성유도주의 경우 CCCP가 존재할 때와 존재하지 않을 때 MIC값이 8배 차이를 나타내 내성발현에 efflux pump가 관련됨이 간접적으로 증명되었다. 항균제 작용부위인 gyrase 에 대해 76번은 91Tyr에서 91Tyr95Asn형태로, 92번은 변이가 없다가 95Asn로 치환되었으며 topoisomerase IV에는 치환이 일어나지 않았다. SDS-PAGE를 이용한 원균주와 내성유발주 OMP분석을 통해 29 50kDa 단백질의 발현량 차이를 확인하였고 2-DE를 수행하여 MALDI TOF, MS/MS 분석으로 단백질 동정을 수행하고 있다. 결론 : 내성유도를 통해 얻어진 내성주와 원균주를 비교 시험한 결과 항균제 작용부위의 돌연변이보다는 지금까지 알려지지 않은 efflux pump 및 porin발현양 변화와 관련이 클 것으로 추정되어 향후 내성 기작 연구에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 이를 SDS-PAGE 및 2-DE로 분석했을 때 발현량에 차이를 보였던 단백질 동정이 완료되면 새로운 내성기작 규명에 기여할 것으로 사료된다.

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