프로테옴 분석으로 확인된 폐렴구균의 GrpE 단백의 기능유전체학적 접근

초록

목적 : 폐렴구균의 스트레스 반응에 대한 프로테옴 분석을 통해 발굴한 GrpE 단백질의 특성 및 기능 규명과 함께 스트레스 반응에서의 GrpE의 방어기전 및 병원성과의 관련성 여부를 규명하기 위하여 우선 유전자의 구조 분석을 실시하고 대량 발현시스템을 구축하고자 하였다. 방법 : 병원성 균주인 D39 균주(혈청형 2)를 대상으로 grpE 유전자를 포함하는 dnaK operon 부위의 염기서열 분석을 실시하고, ORF 부위 및 전사조절 부위 등을 확인하였다. 유전자의 ORF가 포함되도록 primer를 제작한 후 PCR을 실시하여 pQE-30 vector에 클로닝하여 E. coli M15에 형질전환하여 재조합 클론을 제작하였다. IPTG 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고, 대량 발현조건을 확립하였다. 한편, Ni-NTA agarose affinity chromatography를 이용하여 재조합 단백질을 native condition 하에서 정제하였으며, 분리정제한 재조합 단백질은 토끼에 피하면역하여 polyclonal antibody를 제조하였다. 결과 : 폐렴구균 D39의 유전자를 포함하는 dnaK operon 부위(약 6.5kb)의 염기서열 분석 결과, ORF 1~4 부위가 확인되었으며 이는 분자량 약 39, 20, 65, 40kDa의 단백질을 암호화하며, BLAST search 결과 hrcA, grpE, dnaK, dnaJ 유전자임을 확인하였다. 또한, hrcA 유전자의 upstream 부위에서 -35(TTGACA)와 -10(TATAAT)에 해당하는 α^ type promoter sequence와 2개의 CIRCLE element(TTA GCA CTC N9 GAG TGC TAA)가 확인되어 dnak operon상의 유전자들의 전사 조절에 관여할 것으로 추정된다. grpE 유전자의 ORF 부위의 삽입이 최종 확인된 E. coli SDGA14(pQE30-Ga14 plasmid)균주에 0.1mM IPTG를 3시간 처리하였을 때 28 kDa 부근에서 His-taq 융합 형태의 재조합 단백질의 발현이 유도되었다. 분리정제한 GrpE 단백질을 항원으로 이용하여 토끼에 5주 간격으로 3회 피하주사하여 GrpE 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 제조하였다. 결론 : 본 1차 년도에는 폐렴구균에서 grpE 관련 유전자군의 특성 규명을 실시하고 재조합 GrpE 단백질 및 항체를 확보하였다. 이를 바탕으로 향후 GrpE 단백질의 생리활성기능 규명 및 병원성 인자와의 관련성을 확인하고자 한다.

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