간염 및 소아설사 바이러스질환에 대한 특이진단법 개발

초록

목적 : Heptitis C virus와 더불어 간경화증이나 간암등의 만성 간질환을 일으키며 전세계적으로 3억 5천여명의 만성보균자들에 의한 감염이 아직도 문제가 되고 있는 hepatitis B virus(HBV)와 소아에서 특히 여름철에 유행하는 무균성수막염 및 소아설사의 원인이 되는 바이러스중의 하나인 echovirus의 진단제 개발을 위해서는 우선 이들 바이러스의 분리정제가 필수적으로 선행되어야 한다. 본 연구에서는 HBV의 진단을 위해 환자 혈청으로부터 hepatitis B surface antigen(HBsAg), hepatitis B e antigen(HBeAg), anti-HBs 및 anti-HB core 항체를 검색하는 ELISA 혹은 Western blot kit들이 이미 개발되어 있지만 좀 더 감도 및 특이도가 높은 진단제의 자체 개발을 통해 비용절감을 추구하고자 하였다. 방법 : HBV와 echovirus에 특이한 진단제의 개발을 위해 HBV와 echovirus를 분리정제하여 단클론 항체를 제작하였고 국내에서 분리된 B형 간염바이러스의 단백질에 대응하는 유전자의 서열을 비교 분석하여 항원변이를 추정하였으며, 바이러스 유전자를 발현시켜 바이러스감염에 대한 항체측정용 항원으로 사용할 수 있는지 검증하여 백신 개발 가능성을 타진하여 바이러스 유전자를 expression하고 환자혈청에 존재하는 항체를 인식하는 면역 인식 능력을 비교 분석하였다. 정상 성인의 말초혈액내 단핵구를 얻어서 시험관 내에서 배양하면서 보관하고 있는 echovirus를 직접 감염 시켜 apoptosis가 일어나는지를 관찰하고, 기존에 알려진대로 apoptosis를 억제하는 adenovirus의 감염과 함께 대조군으로 조사하여 직접적인 apoptosis의 증거를 얻고자 하였다. 결과 : HBV와 echovirus에 대한 단클론항체가 각각의 바이러스에 대한 특이한 반응을 보임을 ELISA에 의해 확인하였다. 또한 주요한 설사 유발바이러스인 SRSV의 capsid gene을 cloning하고 expression시켜 혈청학적 진단법 개발을 위한 기반을 마련하였다. HBV genome의 nucleotide 변이를 검색한 결과 preS2와 S region의 165와 681 nucleotides 중 7 곳 및 22곳에서 변이를 확인하였고 preS1 region에서는 변이가 검출되지 않았다. 이러한 변이는 아미노산 변이에도 영향을 미쳐 PreS2 아미노산 55개 중 4 군데에서, S 아미노산 226개 중 14곳에서 아미노산 서열이 변했음을 알 수 있었다. 또한 무균성 수막염 환자에서 제대 혈액에서 얻은 단핵구를 가지고 바이러스와 함께 배양하면서 apoptosis를 측정해 본 결과 바이러스를 넣지 않은 대조군과 비교하여 apoptosis의 차이는 볼 수 없었다. HBV와 echoviruses 및 coxsackieviruses에 대한 multivalent recombinant epitope을 이용한 protein dot blot system을 개발하기 위하여 HBV의 주요 epitope을 발현시켰고 echoviruses와 coxsackieviruses의 conserved variable region을 선정하여 각각의 region에 대한 oligonucleotide를 제작하였다. 이러한 oligo를 annealing하여 fragment 들을 만들었고 이 중 한 fragment는 Echo 9에 대한 항체에 대해 특이한 반응을 보였다. 결론 : 선정된 발현산물의 적정 항원성 유지여부와 발현 및 순수정제의 수월성에 의거하여 가장 적합한 발현 system을 확인하고 적정 항원성이 확인된 epitope들을 유전자 재조합에 의해서 fusion하고 이를 발현 시켜 이종 바이러스 다가 진단제의 가능성을 확인하였다. echovirus-specific recombinant epitopes의 확보를 가능성을 보여주었고 기타 특정한 strain 또는 species의 CVR 재조합 epitopes의 제작과 함께 정밀진단용 'multivalent epitopes pool'의 구성이 가능할 것으로 사료된다.

키워드