뎅기열 백신후보물질 개발 및 신규 플랫폼 생산 표준화 연구

초록

ㅁ 연구목표 ㅇ 뎅기 바이러스 백신후보물질 개발 및 신규 플랫폼 생산 표준화 연구를 통한 감염병 대응 역량 강화 ㅁ 연구내용 및 결과 ㅇ 표준 바이러스 확보 및 역가측정 - 국가병원체자원은행(NCCP) 및 병원성바이러스은행(고려대)을 통해 임상 분리주 뎅기 바이러스 분양(4종의 DENV -1, 2, 3, 4 혈청형 확보) - 바이러스 대량배양, 역가측정 및 농축을 통한 효능평가 시험용 바이러스 확보 ㅇ 신규 항원 물질 제작을 위한 유전자 분석 및 항원 설계 - in silico로 뎅기 바이러스의 유전자 서열을 분석하여 항원 설계 ㅇ 뎅기열 백신 효능평가를 위한 감염동물모델 시험법 확립 및 병원성 분석 (모델선택) - 뎅기 감수성 마우스 모델(Ifnar1 -/ - mouse)에 공격 접종을 통한 LD50 확보 ㅇ 신규 항원물질 제작, 생산, 정제, 발현 확인 및 대량확보(표준물질 확보) - 핵산 후보물질(mRNA)을 IVT(in vitro transcription) 기술로 합성, 정제, 발현 조건 확립 및 대량 항원 확보 ㅇ 마우스(C57BL/6 또는 Balb/c)에 확보된 신규플랫폼 백신 후보물질에 대한 1차 면역원성 평가 - 체액성 면역(중화항체가), 세포매개성 면역 등 면역원성 비교 분석 - 뎅기 바이러스 검출법 확립(Real -time PCR 등) ㅇ 백신 효능평가 표준평가법 구축 - 체액성 면역 측정(ELISA, FRNT, PRNT 등) - 세포성 면역 측정(IFN -γ ELISpot, IFN -γ+CD4+ 및 IFN -γ+CD8+ T cell FACs 등) - 면역 지표 Cytokine(IL -10, IL -6, IL -4, IP -10, IFN -γ, TNF -α, IL -12 등)을 real -time PCR로 측정 ㅇ 항원 함량, 투여 횟수, 기간 및 접종 방법 비교 - 백신후보물질에 대한 항원 함량, 접종 방법 및 기간 설정 ㅇ 뎅기 바이러스에 감수성이 있는 표준 동물모델에서 후보물질 효능평가 - 신규 백신후보물질의 최종 방어능 평가 - 조직 내 뎅기 바이러스 역가측정(Real -time PCR) ㅁ 기대효과 및 활용방안 ㅇ 국내 개발 뎅기열 신규 백신후보물질 개발 및 이에 대한 실용화 추진 ㅇ 효능평가 시험법 및 표준물질 제조기술 등의 확보로 다른 신·변종 감염병 백신 개발 시 활용 가능 ㅇ 국내 뎅기열 백신 개발을 위한 표준 동물모델 구축으로 비임상지원 기반 마련

Dengue virus, the most common flavivirus, is occurring highly endemic infectious diseases of tropical countries and is becoming a serious public health problem. However, immunogenicity on the structural viral protein of dengue virus has not been fully understood yet. Here, we investigated prediction of epitope-based immunogenicity ondengue-viral proteins of 4 serotypes with in silico analysis and performed the efficacy evaluation in vitro. We focused analysis on envelope (E) which contains domain III (EDIII) to figure out immunogenicity for human. The epitope regions of linear B cell showing the immunogenicity were predicted via BepiPred-2.0 determined by its sensitivity and specificity. In addition, we also analyzed the regions of immunogens that induce T cell-mediated immune response employing the Immune epitope database (IEDB) resource that validates peptide presented on HLA class I. The 9-mer candidates were selected by scoring whether over than 0.1 or not compared to between epitopes and non-epitopes as indicated reference. Then we conducted T cell proliferation assay with the determined candidates via CFSE analysis method to identify whether the results are proportional to the in silico data. And then Balb/c mice were boosted by determined peptides showing immunogenecity in CFSE assay and spleen was harvested. Interestingly, we found some 9-mer peptides that highly regulated cytokines such as IFN-r, TNFa and IL-4. through ELISpot and qRT-PCR. Futhermore, sera were collected after boosting 2weeks apart. To invsetigate cellular immunity of the sere, we performed PRNT assay. Plus, we did vaccine efficacy test with HLA-A2 humanized mice(NGS-A2) and confirmed change of survival rates. Taken together, our results suggest that in silico data demonstrated many of immunogenic candidates showed high specificity against human B and T lymphocytes, however but it does not fully correspond the results when performing actual immunogenicity assessment. However, some of expected sequences appeared antigen regulates anti-viral cytokine. This study will contribute to the developing vaccines in an appropriate way against dengue virus and be able to be an option or reference for discovering the right vaccine candidates.